Devyser UPD · • Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (ABI cat.#4322682). • Hi-Di Formamide, Genetic...

Devyser UPD-15, Gebrauchsanweisung, 7-A016-DE, Version 2015-05-21 Seite 1 von 19 © Devyser AB 2009-2015


Inhaltsverzeichnis Seite

1. Einführung in den Devyser UPD-15 3

2. Warnung und Vorsichtsmaβnahmen 4

3. Symbole auf den Etiketten 5

4. Benötigte Materialien 6

4.1 Im Kit enthalten 6

4.2 Benötigte Materialien (nicht enthalten) 6

5. Lagerung und Handhabung 7

6. Probenmaterialien 7

7. Gebrauchsanleitung 8

7.1 Arbeitsablauf Devyser UPD-15 8

7.2 Probenzugabe and PCR Amplifikation 9

7.3 Detektion 10

8. Ergebnisse und Analyse 12

9. Limitierungen 18

10. Referenzen 18

11. Information für den Anwender 19

12. Kontaktinformation 19


1. Einführung in den Devyser UPD-15

Verwendungs-zweck Im Kit enthalten Testdurch- führung

Für die Analyse von uniparentaler Disomie des Chromosoms 15 (UPD-15). Der Devyser UPD-15 Kit enthält gebrauchsfertige Reagenzien für die PCR Amplifikation von genetischen Markern. DNA Extraktion – Der Devyser UPD-15 Kit wurde validiert für die Verwendung von DNA aus humanem Vollblut, Fruchtwasser (AF) oder Chorion villi (CV) Biopsien, die mit dem QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, cat# 51104) oder dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, cat# 51304) extrahiert wurde. Amplifikation – Der Devyser UPD-15 Kit wurde mit den ABI GeneAmp® Systemen 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler und MJ Research/Bio-Rad PTC200 mit 96-well alpha unit validiert. Detektion – Zur Detektion der Amplifikationsprodukte können DNA Analysegeräte von Applied Biosystems (ABI PRISM® 310, 3100, 3130, 3500, 3730) verwendet werden, die den Farbstoffsatz G5 unterstützen.

Datenanalyse – GeneScan® und GeneMapper®.

Assayprinzip Die QF-PCR Analyse beinhaltet Amplifikation, Detektion und Analyse von kurzen Tandem Repeat (STR) Markern und von nicht-variablen Markern. Für die Amplifikation jedes chromosomenspezifischen Markers werden fluoreszenz-markierte Primer eingesetzt. Die PCR-Produkte werden mit einem DNA-Analysegerät aufgetrennt und analysiert. Aufgrund der variablen (polymorphen) Natur der verwendeten STR-Marker können die unterschiedlichen DNA-Profile ver-schiedener Individuen voneinander unterschieden werden. Der Polymorphismusgrad der einzelnen Marker, also die Anzahl verschiedener in einer Population vorkommender Allele und damit die „Informativität“ eines einzelnen STR-Markers, ist dabei begrenzt. Typischerweise tritt bei ca. 5—20 % der Individuen einer Population das gleiche Allel also der gleiche STR-Marker auf. Durch die Verwendung mehrerer STR-Marker kann jedoch sichergestellt werden, dass eine einzigartige Kombination von STR-Polymorphismen analysiert wird, die die Unterscheidung verschiedener Individuen erlaubt. Die einzelnen STR-Marker bestehen aus jeweils zwei Allelen, wobei normalerweise eines von der Mutter und eines vom Vater vererbt wurde. Während der Analyse werden die einzelnen Allele des Probanden mit denen der Eltern ver-

glichen.


A. B. C. D. E. F.

G. H

Devyser UPD-15 wurde mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 25µL validiert. Eine Veränderung des Gesamtreaktionsvolumens beeinträchtigt die Leistung des Kits. Beim entnehmen von Aliquots sollte eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermieden werden. Die Verwendung von sterilen Pipetten-spitzen mit Aerosolfiltern wird empfohlen. Reagenzien verschiedener Lots oder verschiedener Röhrchen der gleichen Lots dürfen nicht gemischt werden. Den Kit nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden. Geöffnete oder beschädigte Röhrchen nicht verwenden. Der Arbeitsablauf im Labor sollte nur in der Richtung von Reagenzien-ansatz über DNA-Extraktion, Amplifikation bis zur Detektion hin ver-laufen. Die Präamplifikation sollte mit dem Ansatz der Reagenzien be-ginnen und mit der DNA-Extraktion fortgesetzt werden. Der Ansatz der Reagenzien und die DNA-Extraktion sollten in separaten Bereichen er-folgen. Verbrauchsmaterial und Geräte sollten nicht für andere Arbeiten oder in anderen Bereichen verwendet werden. Es sollten in jedem Bereich Handschuhe getragen und vorm Verlassen gewechselt werden.

Laborausrüstung und Verbrauchsmaterialien zum Ansatz der Reagenzien sollten nicht für die DNA-Extraktion oder zum Pipettieren oder Verarbeiten vervielfältigter DNA oder anderer Ziel DNA verwendet werden. Verbrauchsmaterial und Geräte sollten jeweils in den Bereichen zur Amplifikation und Detektion verbleiben. Die Handhabung der Kitkomponenten, der Proben, deren Gebrauch und Lagerung sollten in Übereinstimmung mit den nationalen Bio-gefährdungs– und Sicherheitsrichtlinien und Regulierungen erfolgen. Beim Umgang mit Proben und Kitreagenzien nicht gepuderte Einmal-handschuhe, Laborkittel und Augenschutz tragen. Nach Umgang mit Proben und Kitreagenzien gründlich Händewaschen.

2. Warnungen und Vorsichtsmaβnahmen


Lot oder Batchnummer

Verfallsdatum

Hersteller

In vitro diagnostik Anzahl der Tests

Lagertemperatur

3. Symbole auf den Etiketten


4. Benötigte Materialien

4.1 Im Kit enthalten

Reagenzien-vorbereitung DNA Extraktion Amplifikation Detektion

• Verbrauchsmaterial für den Thermocycler

• Mikropipette/Dispenser mit Aerosol Filterspitzen.

• Spitzen (10 µL, 20 µL, 100-150 µL)*

• Puder-freie Einmalhandschuhe

• Reagenzien und Materialien gemäß den Gebrauchs-

anweisung des Herstellers

• Mikropipette/Multipipette mit Aerosol Filterspitzen

(5 µL)*

• Thermocycler: ABI GeneAmp® PCR System

9600/9700/2720 oder Eppendorf Mastercycler oder MJ Research/Bio-Rad PTC200 mit 96-well alpha Ein-heit.

• Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM®

310, 3100, 3130, 3500, 3730).

• Performance optimierte Polymere: POP-4, POP-6 oder

POP-7

Konfiguration Komponenten

Der Devyser UPD-15 Kit enthält Reagenzien für die Analyse von maximal 25 Proben. Es wird empfohlen nach der Vor-bereitung den aktivierten Reaktionsmix in geeignete PCR Reaktionsgefäße zu verteilen. Vor dem Dispensieren ist sicherzustellen, dass der Reaktionsmix ausreichend durch-mischt ist (siehe Kapitel 7.1). Den Reaktionsmix in 20 µL Aliquote verteilen und bei – 18 °C lagern. Wiederholtes Auf-tauen und Einfrieren ist zu vermeiden.

4.2 Benötigte Matierialien (nicht enthalten)

Farbe Ver-schluβ

Farbe Röhrchen

Etikett Art.Nr. Kit Inhalt

Orange Klar PCR Activator 4-A018 1x25 test

Gelb Braun Devyser UPD-15 Mix 4-A033 1x25 test


Klinische Proben Verarbeitung und Lagerung

Der Devyser UPD-15 Kit wurde für den Gebrauch mit genomischer DNA aus Vollblut, Amnionflüssigkeit und Chorion-biopsien entwickelt. Wie vom Hersteller angegeben.

A. B. C. D.

Lagerung der Kitkomponenten unterhalb -18°C. Der Reaktions-Mastermix kann bei +2 bis +8°C für mindestens 7 Tage und bei unter -18 °C bis zum Mindesthaltbarkeitsdatum gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden. Die Entsorgung nicht verwendeter Reagenzien und Abfälle ge-schieht unter Beachtung der lokalen oder nationalen Vorschriften Reagenzien aus unterschiedlichen Lots nicht mischen.

Detektion (Forts.)

• DS-33 (Dye set G5) Matrix Standard Kit (ABI

cat.#4345833).

• Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (ABI cat.#4322682).

• Hi-Di Formamide, Genetic Analysis Grade (ABI

cat.#4311320).

• 1x Genetic Analyzer Buffer

• Mikropipette/Multipipette/Dispenser mit Aerosolfilterspitzen

(1,5 µL, 15 µL). Dye Set Kalibrierung: ABI3100/3130/3500/3730: DS-33 Matrix Standard Kit (Dye Set G5) (ABI cat.#4345833). ABI310: DS-33 Matrix Standard Set [6FAM™, VIC®, NED™, PET®, and LIZ® dyes] For The ABI PRISM® 310/377 Systems (ABI cat # 4318159) *) Die Pipetten sollten eine Genauigkeit innerhalb 3% des entsprechenden

Volumens haben. Spitzen mit Aerosolfilter sollten verwendet werden, um Proben- oder Amplikon- Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

5. Lagerung und Handhabung

6. Probenmaterialien

4.2 Benötigte Matierialien (nicht enthalten)(Forts.)


7. Gebrauchsanleitung

Laufgröße

Jeder Devyser UPD-15 Kit enthält Reagenzien für die Analyse von 25 Proben, die gleichzeitig oder einzeln analysiert werden können. Es wird empfohlen immer eine Negativkontrolle (non-template control) und eine Positivkontrolle mit zu analysieren. Um Verunreinigungen zu vermeiden sollten immer ungeöffnete Gefäße verwendet werden. Etwaige Reste des aktivierten Reaktionsmixes sollten verworfen werden.

7. 1 Arbeitsablauf Devyser UPD-15 Der Mastermix sollte vor der Präparation der Proben angesetzt werden, wenn der gesamte Prozess an einem Tag durchgeführt wird. Nur wenn die Proben am Tag vor der Amplifikation präpariert wurden empfiehlt sich die umgekehrte Reihenfolge. Der Reaktions-Mastermix wird durch die Zugabe des Devyser UPD-15 Mix zum PCR Aktivator aktiviert. Der Devyser UPD-15 wurde für ein gesamt PCR-Volumen von 25 µl entwickelt. Wird dieses Volumen geändert, kann sich die Leistung des Kits ändern.

Beachte >>>>>

Reagenzienansatz:

1. Jedes Röhrchen kurz zur Sammlung des Reaktionsansatzes

zentrifugieren. Den Ansatz in diesem Schritt nicht vortexen! 2. 500 µL des Devyser UPD-15 Mix zu einem Röhrchen mit PCR Activator geben. 3. Den Reaktions-Mastermix durch mehrmaliges auf- und abpipettieren der Flüssigkeit vom Boden des Röhrchens mischen. Das Reaktions-Mastermix Röhrchen kurz vortexen und zentrifugieren, um die Flüssigkeit wieder am Boden des Röhrchens zu sammeln. Der Reaktions-Mastermix ist bei +2°C bis 8°C für mindestens 7 Tage stabil. 4. Zugabe von 20 µL des Reaktions-Mastermix zu jedem

PCR Reaktionsgefäß. 5. Die Röhrchen verschließen und kurz zentrifugieren. 6. Der durch die Zugabe von Devyser UPD-15 Mix zu PCR Activator hergestellte Reaktions-Mastermix kann bei +2°C bis +8°C für mindestens 7 Tage und bei unter –18°C für mindestens 30 Tage gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden.


7.2 Probenzugabe und PCR-Amplifikation

DNA Extraktion Gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es wird empfohlen alternative DNA-Extraktionsmethoden und Probenarten gründlich mit dem Devyser UPD-15 Kit zu evaluieren, bevor die Ergebnisse zu diagnostischen Zwecken verwendet werden. Für die empfohlenen PCR-Bedingungen und Analyse-Einstellungen werden optimale Ergebnisse bei der Verwendung von DNA-Konzentrationen zwischen 10 und 20 ng/PCR erzielt.

Probenzugabe Die Probenzugabe sollte in einem Bereich geschehen, der von Reagenzienpräparation, Amplifikation und Detektion getrennt ist. 1. 5 µL der klinischen Probe (10-20 ng/PCR) sowie die Kontrollen den dafür vorgesehenen PCR Reaktionsgefäßen, die den Reaktions-Mastermix enthalten, zugeben. 2. Die Reaktionsgefäßen verschließen und kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Gefäßboden zu sammeln.

Amplifikation Den Thermocycler mindestens 30 Minuten vor Amplifikation anschalten.

- Eppendorf Mastercycler “CNTRL TUBE“ Modus verwenden - GeneAmp® System 9700 „ramp speed“ auf 9600 Modus

setzen - MJ Research/Bio-Rad PTC200 mit 96-well alpha Einheit

“calculated vial temperature” und “MAX” ramping Modus verwenden

Amplifikationsbereich:

Programmierung des Thermocyclers zur Amplifikation gemäß

dem folgenden Thermoprofil (s. Gebrauchsanweisung des Thermocyclers für weitere Informationen zur Programmierung und Betrieb):

95°C 15 Min. 94°C 30 Sek. – 58°C 90 Sek. – 72°C 90 Sek bei 26 Zyklen 72°C 30 Min 4°C DAUERHAFT

1. Reaktionsvolumen auf 25 µL einstellen 2. Amplifikation starten (Dauer etwa 2 Std. 45 Minuten) 3. Nach der Amplifikation die Röhrchen aus dem Thermocycler entnehmen und auf einen geeigneten Träger stellen. Kurz zentrifugieren. Gefäße vorsichtig entnehmen, um Aerosol-Kontaminationen zu vermeiden.


7.2 Probenzugabe und PCR Amplifikation (Forts.)

Amplifikation (Forts.)

Amplifiziertes Material von Bereichen der Präamplifikation fernhalten. Amplifiziertes Material sollte in Bereichen für Amplifikation und Detektion verbleiben.

Probenvor-bereitung

Wartung und Bedienung siehe Handbuch für ABI PRISM® Genetic Analysegeräte. Vor dem Lauf mit einem Devyser UPD-15 Kit muss das Gerät kalibriert werden, um den Farbstoffsatz G5 (Dye-set G5) mit dem verwendeten Polymer zu unterstützen. Zur Vermeidung einer unkorrekten Gröβenbestimmung der zu vergleichenden Allele wird empfohlen die Proben, die miteinander verglichen werden sollen (typischerweise Proband, Mutter & Vater) zusammen auf dem DNA-Analysegerät und unter den gleichen Laufbedingungen zu analysieren. Probenvorbereitung für ABI 310/3100/3130/3500/3730

1. Herstellung eines Ladepuffers bestehend aus 2 µL Gröβenstandard (Gene-Scan-500 LIZ) per 100 µL Hi-Di Formamide (für jede zu analysierende Probe werden 15 µl Ladepuffer benötigt). 2. 15 Sekunden vortexen. 3. 15 µL des Ladepuffers in die entsprechenden Wells der 96-Mikrotiterplatte oder in die Einzeltubes füllen. 4. 1,5 µL des PCR-Ansatzes in die entsprechenden Wells oder Einzeltubes mit dem Ladepuffer zugeben 5. Platte/Einzeltubes verschließen.

7.3 Detektion

95°C 94°C

58°C

72°C 72°C

15 Min 30 Sek

90 Sek

30 Min 90 Sek

4°C

ewig

Umgebungs temperatur 26 Zyklen

Zyklen Final Extension Vordenaturierung


7.3 Detektion (Forts.)

Gerätevorbereitung Erstellen eines “sample sheet” unter Verwendung fol-gender Einstellungen in der “data collection” Software: » Sample ID. » Gröβenstandard wählen: GS500(-250) LIZ muss als

Größenstandard erkannt werden. » Dye Set: G5. » empfohlenes Laufmodul: s.u. für verschiedene

Polymere und Geräte

Laufmodule ABI 310

ABI 3100/3130

ABI 3500

*) die Menge an PCR Produkt, die in die Kapillare injiziert wird, kann variiert wer-

den, indem man Injektionsspannung oder Injektionszeit erhöht oder erniedrigt.

Laufparameter POP-4 POP-6 POP-6

Kapillarlänge 47 cm 47 cm 50 cm

Run temperature 60 60 50

Injection voltage* 15 15 1

Injection time* 5-15 5-15 50

Run voltage 15 15 7,5

Run time 40 min 65 min 5000s

Laufparameter POP-4 POP-6 POP-7

Kapillarlänge 36 cm 36 cm 36 cm

Run temperature 60 60 60

Injection voltage* 2,5 2,5 2,5

Injection time* 20 20 20

Run voltage 15 15 15

Run time 1700 s 3200s 1700 s

Laufparameter POP-7

Kapillarlänge 50 cm

Run temperature 60 ˚C

Injection voltage 1,6 kV

Injection time 15 s

Run voltage 19,5 kV

Run time 1500 s


8. Ergebnisse und Analyse Markerüberblick Devyser UPD-15

1. Laut UCSC Internetseite 2. Basierend auf beobachteten und kalkulierten Markergrößen. Markerpeaks mit Größen außerhalb des angegebenen Bereiches können vorkommen.

Marker ID Position1 Position auf der Karte S. 14

Größenbereich (Bp)2

Farbe

D15S818 15q24.1 7 140-168 Blau

D15S643 15q22.2 6 189-237 Blau

D15S822 15q12 4 240-312 Blau

D15S657 15q26.2 9 323-362 Blau

AMEL Xp22.2

Yp11.2 -

X = 104 Y = 111

(+/- 2bp) Grün

D15S817 15q11.2 1 150-190 Grün

D13S742 13q12.12 - 232-316 Grün

D18S386 18q22.1 - 322-410 Grün

D15S816 15q26.2 8 116-152 Gelb

D15S659 15q21.1 5 162-210 Gelb

D15S1513 15q12 2 228-252 Gelb

D15S1365 15q12 3 270-374 Gelb


1. Laut UCSC Internetseite

Schematische Karte von Chromosome 15

8. Ergebnisse und Analyse (Forts.)

15p13 -

15p11

15q13

15q11

15q12

15q14

15q15

15q25

15q21

15q26

Map Location1 Name

15q11 Breakpoint 1

Breakpoint 2

1 15q11.2 D15S817

15q12 SNURF-SNRPN

15q12 UBE3A

2 15q12 D15S1513

3 15q12 D15S1365

4 15q12 D15S822

15q13.3 Breakpoint 3

5 15q21.1 D15S659

6 15q22.2 D15S643

7 15q24.1 D15S818

8 15q26.2 D15S816

9 15q26.2 D15S657

15q22



Durchführung der Analyse

Die Proben von Proband, Mutter und Vater sollten immer gemeinsam analysiert werden. Bei der Durchführung manueller Analysen ist darauf zu achten, dass die Markerpeaks im Elektropherogramm entsprechend der Tabelle auf Seite 13 detektiert und analysiert werden. Hierbei ist zu beachten, dass Markergrößenbereiche abhängig von dem in der Elektrophorese verwendeten Polymer variieren können.

Ergebnis-interpretation

Der Devyser UPD-15 Kit kann für die Diagnose von maternaler oder paternaler uniparentaler Disomie des Chromosoms 15 als auch zur Detektion einer Deletion der PWS / AS kritischen Region (15q11—15q13) auf dem maternalen oder paternalen Chromosom 15 eingesetzt werden. Um ein Ergebnis als normal zu interpretieren müssen mindestens zwei informative Marker übereinstimmend mit einem di-parentalen und di-allelischen Genotyp sein, während alle anderen Marker nicht informativ sein können. Um ein Ergebnis als anormal zu interpretieren (uniparentale Disomie oder Deletion der 15q11—15q13 Region) müssen mindestens zwei informative Marker übereinstimmend mit einem Resultat für uniparentale Disomie oder einer Deletion der PWS / AS kritischen Region vorhanden sein, während alle anderen Marker nicht informativ sein können.

Einleitung Die häufigste Ursache für Prader-Willi Syndrome (PWS) oder Angelman Syndrome (AS) ist eine Deletion in der 15q11—15q13 Region von Chromosom 15. Die PWS / AS kritische Region (15q11—15q13) ist auf der schematischen Karte von Chromo-som 15 (Seite 14) grau hervorgehoben. Deletionen in der 15q11—15q13 Region geschehen häufig an BP1 oder BP2 als die am häufigsten vorkommenden zentromeren Bruchstellen und BP3 als dem am häufigsten auftretenden telomeren Bruchpunkt. Diese Region enthält ein Cluster von genetisch geprägten Genen. SNURF-SNRP ist ein Beispiel eines paternal exprimierten Gens, während das Gen UBE3A ein Beispiel für ein maternal exprimiertes Gen darstellt. Die im UPD-15 Kit enthaltenen STR-Marker D15S817, D15S1513, D15S1365 und D15S822 sind alle in der 15q11—15q13 Region lokalisiert und können für die Analyse einer Deletion in diesem Bereich herangezogen werden. Die STR-Marker D15S659, D15S643, D15S818, D15S816 und D15S657 befinden sich außerhalb der 15q11—15q13 Region auf dem Chromosom 15 und können zur Analyse einer kompletten Chromosom 15 uniparentalen Disomie herangezogen werden.



Ergebnis-interpretation (Forts.)

Der Devyser UPD-15 Kit enthält weiterhin drei Marker, die nicht auf dem Chromosom 15 lokalisiert sind. Diese Marker dienen zur Bestätigung der Identität der analysierten Proben (Mutter / Vater / Kind). Die Marker D13S742 und D18S386 können ebenfalls für die Detektion von maternalen Zell-kontaminationen verwendet werden. Dies ist eine wichtige Kontrolle, wenn eine pränatale Probe eine maternale UPD-15 aufweist. Wenn ein Marker nicht-schlüssige Ergebnisse liefert oder nicht detektiert wird, können folgende Gründe vorliegen:

• Mosaik

• Partielle Trisomie

• Stutter Phänomen

• -A Peak Phänomen

• Crosstalk zwischen den Farbkanälen

• Elektrophoretische Spitzen

• Bevorzugte Amplifikation mit konsekutiver Verzerrung

• kontaminierende DNA: zweiter Genotyp, PCR Amplikons

• Primerposition Polymorphismus/Änderung

• DNA-Konzentration zu hoch oder zu niedrig

• DNA im PCR Ansatz ist degradiert

• Submikroskopische Duplikationen von einzelnen Markern In seltenen Fällen kann ein Versagen der Amplifikation des PCR-Produktes durch eine Primerbindungsstellenmutation entstehen. Eine solche Mutation wurde für den Lokus AMEL-Y berichtet.

In seltenen Fällen wurde ein Versagen der Amplifikation des Markers D15S1513 beobachtet. Der Grund ist eine Primerbindungsstellenmutation verursacht durch den SNP rs17116344. Wenn normale und anormale Allelmuster für ein einzelnes Chromosom erhalten werden, wird empfohlen weitere Analysen durchzuführen. Wenn das Elektrophoretogramm von schlechter Qualität ist, (vermehrter Crosstalk zwischen den Farbkanälen oder elektrophoretische Spikes) sollten die Daten nicht analysiert werden. Das PCR Produkt kann re-injiziert und re-analysiert werden.



PCR Artefakte Stutterpeaks (Abb. 8.8) werden als Extrapeaks angezeigt, die ein oder mehrere Repeats kleiner als das aktuelle STR Allel sind. Stutterpeaks können in die Verhältniskalkulation einbezogen werden. Die Stutterpeakfläche ist typischerweise weniger als 15 % der entsprechenden STR-Peakfläche. Abb. 8.8 Stutterpeak (Pfeil)

-A Peaks (Abb. 8.9) werden als Extrapeaks angezeigt, die ein Basenpaar kürzer sind, als das PCR-Produkt in seiner vollen Länge (+A Peak). –A Peaks können in die Verhältniskalkulation einbezogen werden. Abb. 8.9 –A und + A Peaks

+A peak

-A peak



Elektrophoretische Artefakte/ Detektions-artefakte

Crosstalk zwischen den Farbkanälen kann während der Detektion auftreten (Abb. 8.10). Crosstalk-Peaks sollten von der Analyse ausgeschlossen werden. Abb. 8.10 Crosstalk Peak (vom grünen zum blauen Kanal)

Elektrophoretische Spitzen (Abb. 8.11) können während der Detektion als scharfe Peaks in verschiedenen Farbkanälen auftreten. Elektrophoretische Spitzen sollten von der Analyse aus-geschlossen werden.

Abb. 8.11. Elektrophoretische Spitzen im Rechteck

8.11


9. Limitierungen

10. References

A. B. C. D.

Dieses Produkt sollte nur von in der PCR Technik trainiertem Personal verwendet werden. Devyser UPD-15 wurde validiert mit ABI Thermocyclern GeneAmp® 9600/9700/2720, Eppendorf Mastercycler and MJ Research/Bio-Rad PTC200 mit 96-well alpha Einheit. Es wird empfohlen andere Thermocycler gründlich mit dem Devyser UPD-15 Kit zu evaluieren, bevor Ergebnisse für die klinische Diagnostik verwendet werden. Der Devyser UPD-15 Kit wurde validiert mit QIAamp DNA Blood Mini Kit für DNA-Extraktion aus humanen Blutzellen und Amnionflüssigkeit; QIAamp DNA Mini Kit für DNA-Extraktion aus CV Biopsien. Die Kitperformance mit anderen Matrizen und DNA-Extraktionskits wurde nicht untersucht und könnte falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse bringen. Devyser UPD-15 sollte nur zur Detektion von uniparentaler Disomie des Chromosoms 15 (UPD-15) gemäß der Gebrauchsanleitung verwendet werden. Der Test wurde nicht für die Detektion von strukturellen Veränderungen, Mosaikphänomenen oder Anomalitäten anderer Chromosomen entwickelt. Ergebnisse, die mit dem Devyser UPD-15 Kit erhalten werden, können nur direkt mit dem verwendeten Probenmaterial korreliert werden. Kontaminationen mit mütterlichem

Zellmaterial und Gebärmutter-Mosaike können Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen des Devyser UPD-15 und anderer Techniken ergeben .

1. Practice Guidelines for Molecular Analysis of Prader-Willi and Angelman Synd-romes. Simon C Ramsden, Jill Clayton-Smith, Rachael Birch and Karin Buiting


11. Information für den Anwender

12. Kontaktinformation

13. Überarbeitungshistorie

Version 2015-05-21 Kapitel 8 (Ergebnisse und Analyse), Seite 15: Der folgende Satz wurde dem Abschnitt für Resultatinterpretation hinzugefügt: In seltenen Fällen wurde ein Versagen der Amplifikation des Markers D15S1513 beo-bachtet. Der Grund ist eine Primerbindungsstellenmutation verursacht durch den SNP rs17116344.

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Jun-2012 Erste Publikation.

Ergebnisse des Devyser UPD-15 sollten im Zusammenhang mit dem Gesamtbild aus klinischen und Laborergebnissen interpretiert werden. Devyser AB übernimmt keine Verantwortung für getroffenen klinischen Entscheidungen. Der Kauf des Produkts bedeutet nicht den Erwerb einer Lizenz PCR durchzufüh-ren, die unter dem Patentschutz einer dritter Seite steht.

Devyser AB Instrumentvägen 19 SE-12653 Hägersten SCHWEDEN Tel.: +46 (8) 562 15 850 Homepage: www.devyser.com Technischer Support Phone: +46 (8) 562 15 850 E-mail: [email protected]

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