PCRPCRPolymerase-KettenreaktionPolymerase-Kettenreaktion

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

Die Die PCRPCR ist eine M ist eine Mööglichkeit Abschnitte glichkeit Abschnitte einer DNA keiner DNA küünstlich zu vervielfnstlich zu vervielfäältigen ltigen

PCRPCR

Kary MULLISKary MULLIS(1993 (1993 Nobelpreis Nobelpreis für Chemie)für Chemie)

DNA-PolymeraseDNA-Polymerase In allen In allen

LebewesenLebewesen Verdoppelt Verdoppelt

DNA vor DNA vor ZellteilungenZellteilungen

Erzeugt einen Erzeugt einen Komplementär-Komplementär-strang an strang an geöffneter DNAgeöffneter DNA

DurchführungDurchführung

Vervielfältigung eines Vervielfältigung eines kurzen, genau definierten kurzen, genau definierten Teils eines DNA-Stranges Teils eines DNA-Stranges (Gen, Teile eines Gens, (Gen, Teile eines Gens, nicht codierende nicht codierende Sequenzen)Sequenzen)

Was wird gebraucht:Was wird gebraucht:

Die zu vervielfältigende Original-Die zu vervielfältigende Original-DNADNA

Zwei Primer (Starthilfen) für Zwei Primer (Starthilfen) für Anfang und Ende der SequenzAnfang und Ende der Sequenz

Polymerasen um den Abschnitt zu Polymerasen um den Abschnitt zu kopierenkopieren

Nukleotide zum Bau der Kopie-Nukleotide zum Bau der Kopie-SequenzenSequenzen

Der AblaufDer Ablauf

Jeder PCR-Prozesss Jeder PCR-Prozesss besteht aus einer Serie besteht aus einer Serie von 20 -30 Zyklen.von 20 -30 Zyklen.

Jeder Zyklus besteht aus Jeder Zyklus besteht aus 3 Schritten3 Schritten

1. Schritt: Schmelzen1. Schritt: Schmelzen

Die DNA wird auf 96Die DNA wird auf 96o o C C erhitzt,erhitzt,dabei werden die Basenpaar-dabei werden die Basenpaar-bindungen aufgebrochen. bindungen aufgebrochen.

Die DNA ist nun in 2 Die DNA ist nun in 2 Einzelstränge getrennt Einzelstränge getrennt (Melting)(Melting)

2. Schritt: Anlagern2. Schritt: Anlagern

Nach Trennung der Stränge Nach Trennung der Stränge wird die Temperatur auf 68wird die Temperatur auf 68oo C gesenkt.C gesenkt.

Jetzt lagern sich die Primer Jetzt lagern sich die Primer an die einzelnen Stränge an an die einzelnen Stränge an (Annealing).(Annealing).

3. Schritt: Verlängerung3. Schritt: Verlängerung

Bei 72Bei 72oo C beginnt die C beginnt die DNA-Polymerase an den DNA-Polymerase an den angelagerten Primern mit angelagerten Primern mit dem Anbau neuer dem Anbau neuer komplementärer Stränge komplementärer Stränge (Elongation)(Elongation)

Taq-PolymeraseTaq-Polymerasevon Thermus aquaticusvon Thermus aquaticus

Verwendet wird eine Verwendet wird eine hitzestabile DNA-Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase aus dem Bakterium aus dem Bakterium Thermophilus aquaticusThermophilus aquaticus

VervielfVervielfäältigungltigung

Durch häufiges Wiederholen Durch häufiges Wiederholen dieses Vorganges wird eine dieses Vorganges wird eine exponentielle exponentielle Vervielfältigung Vervielfältigung (Amplifizierung) dieses DNA (Amplifizierung) dieses DNA Abschnittes erreicht. Abschnittes erreicht.

ThermocyclerThermocycler

ElektrophoreseElektrophorese

Die Trennung der vermehrten Die Trennung der vermehrten DNA-SequenzenDNA-Sequenzen

Schema zur Gensortierung

Durch PCR vermehrte Gensequenzen

Gensequenzen nach Größe sortiert JG

Elektrophorese mit Agar-Elektrophorese mit Agar-GelGel

Die Länge des PCR-Produkts Die Länge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden .bestimmt werden .

Elektrophorese von PCR vervielfältigter DNA-Fragmente.

•(1) Vater, (2) Kind, (3) Mutter. Das Kind hat Teile der Fingerabdrücke der beiden Elternteile geerbt wodurch es über einen eigenen, einzigartigen Fingerabdruck verfügt.

AnwendungAnwendung

Gerichtsmedizin (Forensik)Gerichtsmedizin (Forensik) VaterschaftstestVaterschaftstest KrankheitsnachweisKrankheitsnachweis StammbaumanalyseStammbaumanalyse Nachweis gentechnischer Nachweis gentechnischer

VeränderungenVeränderungen Klonierung von GenenKlonierung von Genen Analyse fossiler DNAAnalyse fossiler DNA

Thank you for your Thank you for your attentionattention