Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in vitro

Aktivtität von Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber

B. fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von:

Stefanie Rossi, geb. Hoffmann

geboren am 18.03.1980 in Bad Langensalza

angefertigt am:

Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig

Betreuer:

PD Dr. med. Reiner Schaumann

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom:

24.09.2013

"Wenn man denkt, es geht nicht mehr, hat man immer noch zwei Drittel seiner Kräfte."

Dr. Horst Köhler

Für David, Emma und Luis - Ich liebe Euch.

Inhaltsverzeichnis

I

I Bibliographische Beschreibung IV

II Abkürzungsverzeichnis V

1 Einleitung 1

1.1 Definition von Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) der

antimikrobiellen Therapie 1

1.2 Definition von Wirkmechanismus, Wirktyp, Wirkspektrum und Wirkintensität von

Antibiotika 1

1.3 Minimale Hemmkonzentration (MHK) 3

1.3.1 Methoden zur Bestimmung der MHK 3

1.3.2 Einteilung der Grenzwerte 4

1.4 Pharmakokinetisch/pharmakodynamisches Modell (PK/PD-Modell) 5

1.5 Postantibiotischer Effekt 7

1.6 Fluorchinolone 8

1.6.1 Levofloxacin 11

1.6.2 Moxifloxacin 13

1.7 Resistenzsituation, Formen und Mechanismen der Resistenz 15

1.8 Physiologische Bakterienflora des gastrointestinalen Trakts 17

1.9 Epidemiologie, Klinik und Therapie von intraabdominellen Infektionen 18

1.10 E. coli - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger 21

1.11 B. fragilis - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger 22

2 Zielstellung 24

3 Material 25

3.1 Geräte und Arbeitsplatz 25

3.2 Laborbedarf 25

3.3 Nährmedien zur Anzucht der verwendeten Bakterienkulturen und

Bakteriensuspensionen sowie Materialien zur Bestimmung der MHK 26

Inhaltsverzeichnis

II

4 Methoden 28

4.1 Untersuchte Bakterienstämme 28

4.2 Anzucht der Bakterienkulturen 28

4.3 Untersuchung zur Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf

supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agar 29

4.4 Bestimmung der MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin 29

4.5 PK/PD-Untersuchung von Levofloxacin und Moxifloxacin 30

4.6 Herstellung der Antibiotikasuspensionen 32

4.6.1 Herstellung der Inokula für die Versuche 33

4.6.2 Versuchsdurchführung 34

4.6.3 Ablesung der Versuchsergebnisse und Berechnung der Abtötungsraten 36

4.6.4 Berechnung der pharmakologischen Indizes 37

4.6.5 Statistische Datenanalyse 38

5 Ergebnisse 39

5.1 Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf supplementiertem Columbia-

Gentamicin-Agar und Beschreibung der Bakterienstämme 39

5.2 Ergebnisse der MHK-Bestimmung 40

5.3 Aktivität von Levofloxacin und Moxifloxacin im in vitro PK/PD-Modell 41

5.3.1 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter

aeroben und anaeroben Bedingungen 41

5.3.2 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter

aeroben und anaeroben Bedingungen 42

5.3.3 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen in Monokultur 44

5.3.4 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm ATCC 25922 in Mischkultur 44

5.3.5 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 4050 in Mischkultur 46

5.3.6 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm BK 12944 in Mischkultur 48

5.3.7 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 6886 in Mischkultur 49

Inhaltsverzeichnis

III

5.3.8 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 4050 in Mischkultur 51

5.3.9 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm BK 12944 in Mischkultur 52

5.3.10 Zusammenfassung der PK/PD-Untersuchung 54

5.3.11 Pharmakologische Indizes 54

6 Diskussion und Ausblick 57

7 Zusammenfassung der Arbeit 63

8 Literaturverzeichnis 65

9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 76

10 Danksagung 77

11 Lebenslauf 78

12 Veröffentlichungen der Arbeit 80

Anhang 1-3 81

Bibliographische Beschreibung

IV

I Bibliographische Beschreibung

Stefanie Rossi, Assistenzärztin der Inneren Medizin

Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in vitro Aktivtität von

Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber B. fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur

Universität Leipzig, Dissertation

92 S., 190 Lit., 25 Abb., 20 Tab., 3 Anlagen

Referat:

Bei intraabdominellen Infektionen findet sich häufig ein polymikrobielles Erregerspektrum

aus fakultativ und obligat anaeroben Bakterien. Natürliches Habitat der dabei am häufigsten

isolierten Erreger E. coli und B. fragilis ist der gastrointestinale Trakt. Durch Störungen der

Darmwandintegrität und nachfolgendem Eindringen der Bakterien in eine sterile Umgebung,

wie beispielsweise der Peritonealhöhle, kann es zur Infektion kommen. Die häufigste Form

der intraabdominellen Infektionen ist die sekundäre Peritonitis. Die Therapie erfolgt

chirurgisch, begleitet von einer antibiotischen Therapie. Dabei sind Kenntnisse über

Wirksamkeit und Empfindlichkeit der Erreger gegenüber den verwendeten Antibiotika von

entscheidender Bedeutung.

In dieser Arbeit wurden die MHK-Werte von vier B. fragilis und vier E. coli Stämmen für

Levofloxacin und Moxifloxacin bestimmt, wobei ein B. fragilis und drei E. coli Stämme

resistent gegenüber Levofloxacin und Moxifloxacin waren. Anschließend wurden mit einem

in vitro PK/PD-Modell die pharmakodynamischen Effekte von Levofloxacin und

Moxifloxacin in Mono- und Mischkulturen von B. fragilis und E. coli untersucht. Die

Monokulturversuche mit E. coli Stämmen wurden sowohl unter aeroben als auch anaeroben

Bedingungen durchgeführt. Durch die Untersuchung von Aktivität und Wirksamkeit von

Levofloxacin und Moxifloxacin in vitro können Aussagen über eine mögliche Verwendung

bei intraabdominellen Infektionen getroffen werden. Levofloxacin wirkte auf den sensiblen E.

coli Stamm nur unter aeroben Bedingungen bakterizid, nicht jedoch unter anaeroben

Bedingungen. Hingegen wirkte Moxifloxacin in aerober und anaerober Umgebung bakterizid

auf diesen E. coli Stamm. In den Mischkulturen zeigte Moxifloxacin eine bessere in vitro

Aktivität als Levofloxacin, wobei Moxifloxacin allerdings auch nur eine moderate Aktivität

hatte. Aufgrund der Ergebnisse könnte Moxifloxacin dennoch eine theraupeutische Option

bei der Behandlung intraabdomineller Infektionen bieten. Der Einsatz dieser Substanzen

sollte jedoch nicht unkritisch erfolgen.

Abkürzungsverzeichnis

V

II Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosintriphosphat

AUC Fläche unter der Kurve (Area under the curve)

CAP Amulant erworbene Pneumonie (Community acquired

pneumonia)

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute

Cmax Maximal erreichbare Plasmakonzentration

CYP450 Cytochrom P450

DIN Deutsches Institut für Normung

DNA Desoxyribonukleinsäure (Deoxyribonucleic acid)

EARSS European Antimicrobial Resistance Surveillance System

EUCAST European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing

FDA US Food and Drug Administration

GABA Gamma-Aminobuttersäure

h Stunde(n)

i intermediär

i.v. intravenös

IDSA Infectious Diseases Society of America

ISO International Standard Organisation

KBE Koloniebildende Einheit

l Liter

LEV Levofloxacin

LPS Lipopolysaccharid

mg Milligramm

MHK Minimale Hemmkonzentration

MHK50 Niedrigste Konzentration, welche die Vermehrung von

mindestens 50% der untersuchten Stämme hemmt

MHK90 Niedrigste Konzentration, welche die Vermehrung von

mindestens 90% der untersuchten Stämme hemmt

ml Milliliter

MOX Moxifloxacin

n Anzahl untersuchter Stämme

Abkürzungsverzeichnis

VI

NSAR Nichtsteroidale Antirheumatika

p.o. per os

PAE Postantibiotischer Effekt

PEG Paul-Ehrlich-Gesellschaft

PK/PD Pharmakokinetisch/pharmakodynamisch

r resistent

RMA Stammbezeichnung von B. fragilis Stämmen des R. M. Alden

Research Laboratory, Santa Monica, CA, USA

RNA Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)

s sensibel

SIS Surgical Infection Society

spp. Species

T>MHK Zeit oberhalb der MHK

vs. versus

WAL R Stammbezeichnung von B. fragilis Stämmen aus einer

internationalen Anaerobierstudie

ZNS Zentralnervensystem

Einleitung

1

1 Einleitung

Als Grundgedanke der antiinfektiven Therapie kann das Ehrlichsche Prinzip der selektiven

Toxizität Anwendung finden. Es beschreibt den selektiven Angriff der Antiinfektiva an

Strukturen der Mikroorganismen, welche beim Wirtsorganismus (Mensch) nicht oder in

wesentlich anderer Form vorkommen [119].

1.1 Definition von Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) der

antimikrobiellen Therapie

Die Pharmakologie der antimikrobiellen Therapie wird durch die Begriffe der

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik beschrieben.

Der 1953 erstmalig von F. H. Dost verwendete Begriff der Pharmakokinetik beschreibt die

Konzentrationsveränderungen des Antibiotikums im Organismus in Abhängigkeit von der

Zeit. Endogene Prozesse wie Resorption, Verteilung, Biotransformation und Elimination

bedingen diese Veränderungen. Die Zusammensetzung des Antibiotikums, sowie

Applikationsart und -ort fallen ebenso unter diesen Begriff [45, 185].

Die Pharmakodynamik beschreibt die Beziehungen zwischen der Konzentration des

Antibiotikums und dem hervorgerufenen antimikrobiellen Effekt. Dadurch lassen sich

Parameter wie Wirkprofil, Wirkqualität, Effektivität der Wirkung und Wirkintensität

ermitteln.

Die pharmakodynamischen Effekte der Antibiotika lassen sich in vitro anhand folgender

Parameter analysieren:

� den morphologischen Veränderungen der Bakterien

� der intitialen Abtötungsrate

� der hemmenden Wirkung auf die Vermehrung

� dem postantibiotischen Effekt

� und der effektiven Zeit des erneuten Wachstums nach Antibiotikumexposition [68,

100].

1.2 Definition von Wirkmechanismus, Wirktyp, Wirkspektrum und Wirkinten sität

von Antibiotika

In der großen Gruppe der Antibiotika können Einteilungen nach Wirkmechanismus, Wirktyp,

Wirkspektrum und Wirkintensität vorgenommen werden [67, 119].

Einleitung

2

Der Wirkmechanismus liefert Aussagen über die Angriffspunkte der Antibiotika bei

Bakterienzellen und wird unterschieden nach [74, 165]:

� Hemmung der Zellwandsynthese (z. B. Betalaktam-Antibiotika oder

Glykopeptide)

� Störung der Zellwandpermeabilität (z. B. Polypeptide)

� Hemmung des bakteriellen Stoffwechsels (z. B. Folsäureantagonisten)

� Hemmung der Proteinbiosynthese (z. B. Aminoglykoside, Makrolide)

� Eingriff in die Synthese von Nukleinsäuren oder deren Schädigung (z. B.

Fluorchinolone oder Nitroimidazole).

Beim Wirktyp wird zwischen bakteriostatischem und bakterizidem Wirktyp unterschieden.

Als Bakteriostase wird die Hemmung des Bakterienwachstums bezeichnet. Zu einer Abtötung

der Mikroorganismen kommt es hierbei nicht. Ruhende Bakterien werden nicht beeinflusst.

Bakteriostatisch wirkende Antibiotika, wie Sulfonamide, Tetrazykline oder Chloramphenicol

wirken meist über die Beeinflussung der bakteriellen Proteinbiosynthese.

Kommt es zu einer Abtötung der Bakterienzelle, wird von Bakterizidie gesprochen. Die

Zerstörung der Mikroorganismen kann sowohl in der Vermehrungsphase als auch in der

Ruhephase erfolgen. Beispiele hierfür sind Penicilline, Aminoglykoside und Fluorchinolone.

Weiterhin unterscheidet man eine konzentrationsabhängige und eine weitgehend

konzentrationsunabhängige, zeitabhängige Bakterizidie [38, 89, 119]. Neben der direkten

antibakteriellen Wirkung können bestimmte Antibiotika indirekt antibakteriell durch

Modulation des Immunsystems wirken. Beispielsweise können Makrolide und

Fluorchinolone die Zytokinbildung beeinflussen und Rifampicin kann die T-Zell-Aktivierung

supprimieren [173].

Das Wirkspektrum beschreibt die Aktivität von Antibiotika gegenüber verschiedenen

Bakterienspezies. Hier wird zwischen sogenannten Schmalspektrum- und Breitspektrum-

Antibiotika unterschieden. Schmalspektrum-Antibiotika sind gegenüber wenigen

Bakterienspezies wirksam. Breitspektrum-Antibiotika wirken gegen unterschiedliche

Bakterienspezies [166].

Die Wirkintensität eines Antibiotikums wird durch die Minimale Hemmkonzentration (MHK)

beschrieben und durch die definierten Empfindlichkeitsstufen "sensibel, intermediär und

resistent" kategorisiert.

Einleitung

3

1.3 Minimale Hemmkonzentration (MHK)

Nach DIN 58940-1 ist die MHK definiert als geringste Konzentration eines Antibiotikums

(mg/l), die unter definierten in vitro Bedingungen in einem vorgegebenen Zeitintervall (18 ±

2 h) ein visuell erkennbares mikrobielles Wachstum verhindert [6]. Die minimale bakterizide

Hemmkonzentration (MBK) ist die geringste in vitro gemessene Konzentration, welche nach

6 h zu einem Absterben der Mikroorganismen führt. Eine bakterizide Wirkung liegt bei

Abtötungsraten von mindestens 99,9% vor [6, 166]. Die MHK liefert Aussagen zur aktuellen

Empfindlichkeitssituation in vivo. Es handelt sich um einen prädiktiven in vitro bestimmten

Wert zur wahrscheinlichen Wirkung des Antibiotikums. Es erfolgt häufig eine klinische

Einstufung in die Kategorien "sensibel", "intermediär" und "resistent". Die MHK90 ist die

Antibiotikumkonzentration, welche zur Hemmung von 90% der untersuchten Stämme führt.

Die MHK50 gibt die Konzentration an, welche das Wachstum von 50% der untersuchten

Erreger hemmt [14, 133, 185].

1.3.1 Methoden zur Bestimmung der MHK

Testverfahren müssen standardisiert sein, um reproduzierbare Testergebnisse zu erhalten. Auf

Initiative des Deutschen Instituts für Normung (DIN) gibt es inzwischen eine

Standardisierungsnorm für die Bestimmung der MHK (DIN EN ISO 20776-1). Die

Mikrodilutionsmethode gilt dabei als Referenzmethode der MHK-Bestimmung [5]. Bei

Verwendung unterschiedlicher Standards können sich Diskrepanzen in den Ergebnissen

ergeben. Daher ist die Angabe des verwendeten Standards erforderlich [167]. Die

gebräuchlichsten Methoden werden im Folgenden ausführlicher erläutert.

Dilutionstest Bei diesen geometrischen Verdünnungsreihen können quantitative Aussagen bezüglich der

Empfindlichkeit von Mikroorganismen gemacht werden. Man unterscheidet den

Agardilutionstest von dem Mikro- und Makrobouillondilutionstest. Beim Agardilutionstest

werden standardisierte Bakterienmengen auf entsprechend vorbereitetes Agarmedium geimpft

und nachfolgend inkubiert. Das Agarmedium besteht aus einem geeigentem Nährmedium,

welches mit verschiedenen Konzentrationen des zu testenden Antibiotikums versetzt ist. Zur

Kontrolle wird ein Agarmedium ohne Antibiotikum mit dem standardisiertem Inokulum

beimpft [9]. Vorteil des Agardilutionstestes ist die Möglichkeit der Verwendung mehrerer

verschiedener Bakterienstämme auf einem Agarmedium.

Einleitung

4

Bei der Bouillondilutionsmethode werden mehrere Behältnisse mit gleichen Volumina einer

geeigneten Bouillon sowie gleichen Volumina einer Wirkstofflösung mit allerdings

geometrisch abnehmender Antibiotikumkonzentration mit einem definierten Inokulum

beschickt. Die MHK ist festgelegt als niedrigste Konzentration, welche noch zu einer

sichtbaren Hemmung des Erregerwachstums führt [6, 112, 153].

Gradientendiffusionstest Der Gradientendiffusionstest wurde 1991 weltweit als Epsilometer-Test (Etest®) durch AB

Biodisk eingeführt. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass sich vergleichbare

Ergebnisse zu den Verdünnungsreihen sowie den Diffusionstesten ergeben [19, 105]. Es wird

die einfache Handhabung des Agardiffusionstestes mit der Genauigkeit der Bouillondilution

verbunden, wodurch eine direkte Bestimmung der MHK erfolgen kann. Der Etest® ist ein

vorgefertigter und stabiler Antibiotikumgradient über 15 Verdünnungsstufen auf einem

Kunststoffträgermaterial [3]. Das Antibiotikum diffundiert in das Testmedium und kann das

Bakterienwachstum hemmen. Dabei bildet sich ein ellipsenförmiger Hemmhof um den

Teststreifen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Endpunkte der Hemmhofellipse ergeben den

jeweiligen MHK-Wert.

Abbildung 1: Agarmedium mit 5 Etest®-Streifen und ellipsenförmigen Hemmzonen (aus Baker et al., 1991 [19])

1.3.2 Einteilung der Grenzwerte Nach DIN 58940-1 beschreibt der Grenzwert die MHK bzw. den Hemmhofdurchmesser

(HHD), anhand derer die Erreger nach den Empfindlichkeitsprädikaten oder

Bewertungsstufen "sensibel", "intermediär" und "resistent" voneinander getrennt werden [6].

Einleitung

5

Die Einteilung basiert primär auf pharmakokinetisch/ pharmakodynamischen Beziehungen,

welche durch Studien erhoben werden. Aber auch Faktoren wie Dosierung, unerwünschte

Wirkungen, Resistenzmechanismen sowie klinisches Outcome werden berücksichtigt [84].

Um einen Abgleich der Grenzwerte innerhalb von Europa zu erzielen, wurde die

Arbeitsgruppe des European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)

eingerichtet [85, 86]. Die EUCAST ist ein ständiges Kommittee der European Society for

Clinical Mirobiology and Infectious Diseases (ESCMID). Die Grenzwerte der EUCAST sind

im Internet unter http://www.eucast.org/ verfügbar [8]. Es gibt aber auch andere

Organisationen, die sich mit der Grenzwertfindung beschäftigen [41]. In Amerika werden die

Breakpoints durch das Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, vormals NCCLS =

National Committee of Clinical Laboratory Standards) herausgegeben [35]. Die EUCAST-

Grenzwerte sind häufig niedriger als die der CLSI. Teilweise sind die ausgegebenen

Grenzwerte bei beiden Komitees Bakteriengruppen-spezifisch. In Deutschland werden beide

Bewertungssysteme verwendet. Dabei ist dem klinisch tätigem Arzt meist nicht bekannt, nach

welchem System bewertet wurde [136]. Im Rahmen einer ISO-Arbeitsgruppe wurde als

weltweiter Standard zur Ermittlung der MHK die Mikrobouillondilution festgelegt [136].

"Als sensibel (s) gegen ein bestimmtes Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann

bezeichnet, wenn er in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit

einer hohen therapeutischen Erfolgswahrscheinlichkeit assoziiert ist"[5] .

"Als intermediär (i) gegen ein bestimmtes Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann

bezeichnet, wenn er in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit

einem unsicheren therapeutischen Ergebnis assoziiert ist. Ohne zusätzliche Berücksichtigung

weiterer Kriterien ist eine Beurteilung hinsichtlich eines Therapieerfolges durch das

entsprechende Antibiotikum nicht möglich" [5].

"Als resistent (r) gegen ein Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann bezeichnet, wenn er

in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit einer hohen

Wahrscheinlichkeit des Therapieversagens assoziiert ist. Sind keine ausreichend hohen

Erfolgsraten durch das Antiinfektivum bei klinischen Studien zu erreichen, wird dieses

ebenfalls als "resistent" bezeichnet" [5].

1.4 Pharmakokinetisch/pharmakodynamisches Modell (PK/PD-Modell)

Die MHK ist ein wichtiger Parameter zur Quantifizierung der Aktivität eines Antibiotikums.

Da es sich um einen statischen Wert handelt, können keine Angaben über die Absterbekinetik

oder das Wachstumsverhalten der Erreger gemacht werden. Pharmakokinetische Faktoren des

Einleitung

6

Antibiotikums finden zudem keine Berücksichtigung [38, 59]. Die Interaktion zwischen

Antibiotikum und Bakterium in vitro kann zunächst durch eine Absterbekinetik simuliert

werden. Vorteil gegenüber der MHK ist die Bestimmung von Ausmaß und Geschwindigkeit

der Abtötung oder des Wachstums von Bakterien. Nachteilig ist die konstante

Antbiotikumkonzentration. Eine Möglichkeit zur vergleichenden Betrachtung von

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik lässt sich durch PK/PD-Modelle erreichen [36].

PK/PD-Modelle bieten eine gute Möglichkeit zur Abschätzung der antimikrobiellen

Wirkintensität und Effekte durch Darstellung dynamischer Abtötungskurven. Somit lassen

sich Fragen der Dosierung und der Dosierungsintervalle (zeitabhängige vs.

konzentrationsabhängige Bakterizidie) gezielter beantworten [14, 118, 127]. Vorteile

gegenüber der alleinigen MHK-Bestimmung ergeben sich auch in Aufdeckung von

möglichen postantibiotischen Effekten. Vergleiche unterschiedlicher Antibiotika/-klassen und

die Verwendung von Mischkulturen können durch in vitro PK/PD-Modelle erfolgen [66,

106]. Zudem können pharmakodynamische Unterschiede bei Veränderungen der

Pharmakokinetik, beispielsweise Verlängerung der Halbwertszeit bei Niereninsuffizienz,

simuliert und dargestellt werden [183]. Diese Untersuchungen können in vitro oder in vivo

durch Tierversuche durchgeführt werden. Ein Vorteil der in vitro Modelle gegenüber den

Tierversuchen stellt neben ethischen Gesichtspunkten die Verwendung von Dosierungen dar,

die beim Menschen erreicht werden. Zudem bestehen Unterschiede in der Pharmakokinetik

zwischen Mensch und Tier. Weitere Vorteile der in vitro Modelle sind die meist einfacheren

und kostengünstigeren Durchführungen gegenüber in vivo Untersuchungen [36].

Trotz der vielen Vorteile können in vitro PK/PD-Modelle die Komplexität von in vivo

Infektionen nicht nachahmen: "in vitro models are neither mice or men" [183]. In vitro

PK/PD-Modelle simulieren häufig Vorgänge unter neutropenischen Bedingungen. Deshalb

können auch keine Aussagen zur Abwehrfunktion oder Beeinflussung des Immunsystems

durch Bakterien oder Antibiotika getroffen werden [32, 173].

Im Verlauf der Entwicklung von antimikrobiellen Substanzen wurden PK/PD-Indizes

eingeführt, die zum Vergleich der unterschiedlichen Wirkungen herangezogen werden

können. Dadurch können Aussagen über eine klinische Wirksamkeit getroffen werden. Diese

Indizes sind aus einem pharmakokinetischen Parameter und einem mikrobiologischen

Parameter zusammengesetzt. Die International Society of Anti-Infective Pharmacology

(ISAP), hat eine Arbeit zur einheitlichen Definition der Parameter und Indizes

herausgebracht. Nachfolgend sind die relevanten Parameter und Indizes ausgelistet [21, 116].

Einleitung

7

MHK Minimale Hemmkonzentration [mg/l oder µg/ml]

AUC Fläche unter der Kurve [mg×h/l oder µg×h/ml]

Cmax Maximal erreichbare Plasmakonzentration [mg/l oder µg/ml]

AUC/MHK Verhältnis von AUC zu MHK [dimensionslos]

Cmax/MHK Verhältnis von Cmax zu MHK [dimensionlos]

T>MHK Kumulativer Prozentsatz der Zeit , in welcher die Konzentration des

Antibiotikums oberhalb der MHK des Erregers liegt [%]

Bei der konzentrationsabhängigen Bakterizidie sind hohe Konzentrationen des Antibiotikums

für kurze Zeit nötig, um eine bestmögliche Wirkung zu erzielen. Bei den Aminoglykosiden

korreliert die Spitzenkonzentration oberhalb der MHK mit dem therapeutischen Erfolg

(Cmax/MHK). Für die Fluorchinolone ist neben dem Parameter Cmax/MHK der Parameter

AUC/MHK von besonderer Bedeutung [16]. Die zeitabhängige Bakterizidie fordert konstant

mäßig hohe Wirkstoffkonzentrationen über einen bestimmten Zeitraum zur Erzielung eines

antimikrobiellen Effektes. Der Parameter T>MHK korreliert beispielsweise bei den Betalaktam-

Antibiotika oder Makroliden am besten mit der Effektivität [38, 119]. Nach Drusano et al. hat

der Parameter T>MHK bei den Fluorchinolonen keine Bedeutung für den Erfolg der Therapie

[47].

1.5 Postantibiotischer Effekt

Der Postantibiotische Effekt (PAE) ist nach DIN 58940-1 die Wachstumshemmung für

mehrere Stunden, beziehungsweise die Verzögerung des Wachstums von Mikroorganismen

nach kurzzeitiger Einwirkung einer antimikrobiellen Substanz und deren Entfernung aus dem

Testansatz [6]. Letztlich wird eine Erholungsphase beschrieben, welche die beschädigten,

aber nicht abgetöteten Bakterien zur Regeneration benötigten. Während dieser Zeit kommt es

zu keiner erneuten Vermehrung der Mikroorganismen. Die Mikroorganismen können in

dieser Phase besser durch Leukozyten phagozytiert werden. Diese Phase kann, abhängig von

der antimikrobiellen Substanz, mehrere Stunden betragen. Bei den meisten Antibiotika lässt

sich gegenüber grampositiven Kokken ein PAE nachweisen. Gegen gramnegative Bakterien

findet sich ein PAE bei antimikrobiellen Substanzen, welche die RNA inhibieren oder die

Proteinbiosynthese der Bakterien beeinflussen. Dazu gehören beispielsweise die

Aminoglykoside und Fluorchinolone. Der durch Fluorchinolone hervorgerufene

postantibiotische Effekt gegen gramnegative Bakterien liegt zwischen einer und vier Stunden.

Einleitung

8

Klinische Relevanz ergibt sich bei der Bewertung der Dosierungsintervalle, da bei Vorliegen

eines PAE das Dosisintervall verlängert werden kann [68, 101, 102, 119, 159, 166, 190].

1.6 Fluorchinolone

Im klinischen Alltag werden die Begriffe Gyrasehemmer und Chinolone meist synonym

verwendet. Neben der DNA-Gyrase wird auch die Topoisomerase IV gehemmt, daher ist der

Begriff Gyrasehemmer nicht hinreichend. Auch haben nicht alle Substanzen die klassische

Chinolongrundstruktur. Chemisch gesehen handelt es sich um Chinoloncarbonsäuren und

Aza-Analoge, die ab der zweiten Generation fast ausnahmslos fluoriert sind und in dieser

Arbeit als Fluorchinolone bezeichnet werden [14]. Das erste Analogon dieser synthetischen

Antibiotika wurde 1962 als Nalidixinsäure für die Therapie von Harnwegsinfektionen

zugelassen. Nalidixinsäure wurde eher zufällig bei der Synthese von Chloroquin zur

Malariatherapie als Nebenprodukt entdeckt. Aufgrund sehr ungünstiger pharmakokinetischer

Eigenschaften und einer raschen Resistenzentwicklung findet Nalidixinsäure heutzutage

keine Anwendung mehr. Der Durchbruch der Therapie von Harnwegsinfekten gelang 1978

mit Norfloxacin, dem ersten Fluorchinolon. Von den inzwischen über 10000 synthetisierten

Präparaten wurden bisher nur 2% weiterentwickelt und klinisch getestet [169]. 20

Fluorchinolone sind erfolgreich auf dem Handel zugelassen. Teilweise finden die Präparate

auch Anwendung in der Veterinärmedizin [17, 147]. Die neuen Fluorchinolone unterscheiden

sich in 2 wichtigen Punkten von der Muttersubstanz Nalidixinsäure (Abb. 2): die Einführung

eines Fluoratoms an Position 6 sowie die Substitution einer Piperazinyl- oder Pyrrolidinyl-

Gruppe an Position 7 (Abb. 3). Durch diese Veränderungen besitzen die Substanzen eine

deutlich höhere antibakterielle Aktivität und ein breiteres Wirkspektrum [186] .

NN

O

COOH

C2H5

CH3

Abbildung 2: Nalidixinsäure

6

7X8

5

N12

34F

R7

R5

COOH

R2

R1

O

Abbildung 3: Fluorchinolongrundgerüst

Einleitung

9

� Einteilung

Die Paul-Ehrlich-Gesellschaft (PEG) übernahm 1998 von Naber und Adam eine Einteilung

anhand der in vitro Aktivität der Substanzen, wie in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Einteilung der Chinolone (nach Naber und Adam, 1998 ([120])

Gruppe Eigenschaft Beispiel

I Indikation: Harnwegsinfektion Norfloxacin

II Systemisch anwendbar mit ausgedehntem

Indikationsspektrum

Enoxacin, Ofloxacin,

Ciprofloxacin

III verbesserte Aktivität gegen grampositive und atypische

Erreger

Levofloxacin

IV verbesserte Aktivität gegen grampositive, atypische

Erreger sowie Anaerobier

Moxifloxacin

In Deutschland werden hauptsächlich 3 Substanzen aus diesen Gruppen zur Therapie

eingesetzt: Ciprofloxacin, Levofloxacin und Moxifloxacin [166].

� Wirkmechanismus

Die Fluorchinolone zeigen eine konzentrationsabhängige Pharmakodynamik und wirken

durch Hemmung der Typ II Topoisomerasen bakterizid. Zwei bakterielle Zielstrukturen

werden unterschieden: die DNA-Gyrase und die Topoisomerase IV. Topoisomerasen sind

neben anderen Enzymen notwendig für den reibungslosen Ablauf der DNA-Replikation,

indem sie superhelicale Strukturen entwinden. DNA weist in ausgestreckter Form eine 1000-

fach größere Länge als eine Bakterienzelle auf. Daher muss die DNA mittels Ausbildung von

Superhelices in eine kompakte Struktur überführt werden [165]. Die bakterielle DNA-Gyrase

ist im Gegensatz zu den Topoisomerasen der Säugetiere imstande, unter Verbrauch von ATP

negative Superhelices in ringförmige DNA-Moleküle einzufügen. Sie bestehen aus 2 A- und

2 B-Untereinheiten, gyrA und gyrB, welche durch die Gene gyrA und gyrB kodiert werden.

Die Topoisomerase IV trennt die Bakterienchromosomen nach der Replikation, welches zur

Zellteilung führt [46, 78, 186]. Die Topoisomerase IV besteht aus 2 parC- und 2 parE-

Untereinheiten, welche durch die Gene parC und parE kodiert werden. Bei gramnegativen

Bakterien wie E. coli ist die primäre Zielstruktur die DNA-Gyrase. Bei grampositiven

Bakterien einschließlich S. aureus ist die Zielstruktur die Topoisomerase IV [23]. Bei den

neueren Fluorchinolonen scheint es eine ausgeglichene Balance bezüglich der Affinität zur

Einleitung

10

Zielstruktur zu geben [170]. Eine toxische Wirkung der Fluorchinolone auf eukaryote DNA-

Gyrasen ist sehr unwahrscheinlich, da mindestens 100-fach erhöhte Konzentrationen nötig

sind, um die Aktivität der menschlichen Topoisomerasen zu inhibieren [39, 77, 186].

� Pharmakokinetik

Die Fluorchinolone haben eine lineare Pharmakokinetik [168]. Günstige pharmakokinetische

Eigenschaften führen zu einer hohen Wirksamkeit und guten Sicherheitsprofilen. Die

Plasmaproteinbindung beträgt in Abhängigkeit von der Substanz 10-40%. Bei vielen

Substanzen der Fluorchinolone ist die orale Bioverfügbarkeit sehr hoch und die Absorption

nach oraler Aufnahme erfolgt sehr schnell. Nach 1-2 h erreichen die Serumkonzentrationen

Maximalwerte. Aufgrund langer Halbwertszeiten müssen die jüngeren Fluorchinolone wie

Moxifloxacin nur einmal täglich eingenommen bzw. appliziert werden. Die Fluorchinolone

weisen ein hohes Verteilungsvolumen auf [40, 119]. Durch Veränderungen der chemischen

Strukturen werden Wirkintensität, Wirkspektrum und unerwünschte Nebenwirkungen

beeinflusst. Die DNA-Bindung wird durch die Substituenten C2, C3, C4 und C6 vermittelt.

Durch das Fluoratom an C6 kommt es zu einer verbesserten Zellwandpenetration. Der C7-

Substituent beeinflusst die Wirkintensität und das Wirkspektrum. Optimale Substituenten

scheinen dabei Aminopyrrolidine mit höchster Wirkintensität gegen grampositive Bakterien

oder Piperazine mit verbesserter Wirkung gegen gramnegative Erreger und überlegener in

vivo Aktivität zu sein. Eine Methoxy-Gruppe an C8 erweitert das Wirkspektrum auf

grampositive, atypische und obligat anaerobe Erreger und weist eine geringere Phototoxizität

auf. Durch Alkylierung an Position 7 wird eine höhere sterische Masse erreicht, dadurch

lassen sich auch unerwünschte Wirkungen auf das zentrale Nervensystem, Interaktionen mit

anderen Medikamenten und gentoxische Wirkungen deutlich reduzieren [44, 147, 161].

� Unerwünschte Wirkungen

Die Fluorchinolone haben prinzipiell ähnliche unerwünschte Wirkungen, jedoch kann sich die

Ausprägung bei den einzelnen Substanzen deutlich unterscheiden. Am häufigsten treten

gastrointestinale Beschwerden wie Übelkeit, Magenschmerzen oder Diarrhoe auf [119].

Hepatotoxische und phototoxische Reaktionen sind ebenfalls beschrieben. Sparfloxacin und

Grepafloxacin können schwere kardiale Arrhythmien (Torsade-de-Pointes) aufgrund einer

QT-Verlängerung auslösen [166]. Die zentralnervösen Nebenwirkungen wie Kopfschmerz,

Schwindel, Agitation, Schlafstörungen und in seltenen Fällen cerebrale Krämpfe sind durch

Bindung des C7-Substituenten an GABAA-Rezeptoren vermittelt. Alkylierte Seitenketten wie

Einleitung

11

beispielsweise bei Temafloxacin oder Sparfloxacin binden nur schwach an den Rezeptor.

Ciprofloxacin bindet durch eine Piperazingruppe stark an den Rezeptor [13, 44]. Frühere

Versuche an juvenilen Beagle-Hunden führten zu Knorpelschäden, daher wird empfohlen,

Fluorchinolone bei Kindern vor Abschluss des Wachstums nicht zu verwenden [160]. Jedoch

konnten Untersuchungen in den 90er Jahren keine irreversiblen Erkrankungen der kindlichen

Gelenke aufzeigen [128].

� Indikationen

Mögliche Indikationen der Fluorchinolone sind Harnwegsinfektionen (Ciprofloxacin),

Prostatitis und sexuell übertragbare Krankheiten (Ciprofloxacin, Levofloxacin),

Atemwegsinfektionen (Ciprofloxacin, Levofloxacin, Moxifloxacin), Knocheninfektionen

sowie Haut- und Weichgewebsinfektionen (Levofloxacin), intraabdominelle Infektionen und

Sepsis (Off-Label-Einsatz von Moxifloxacin) [179]. Eine Sonderindikation besteht für

Ciprofloxacin bei nachgewiesenen Infektionen mit P. aeruginosa bei Patienten mit Cystischer

Fibrose. Hier ist der Einsatz bei Kindern und Jugendlichen im Alter von 5 bis 17 Jahren

möglich [4]. In der Literatur finden sich zudem Angaben zur Prävention von Infektionen bei

neutropenischen Patienten mit akuter Leukämie[171].

� Interaktionen

Arzneimittelinteraktionen können bei gleichzeitiger Applikation der Fluorchinolone mit

NSAR oder Theophyllin auftreten. Für Levofloxacin und Moxifloxacin konnte keine

Interaktion mit Theophyllin nachgewiesen werden [114, 161]. Auf eine gleichzeitige

Einnahme von Antazida oder Eisensulfaten sollte verzichtet werden [103, 186]. H2-

Rezeptorantagonisten und Anticholinergika führen zu keiner negativen Beeinflussung der

oralen Bioverfügbarkeit [43, 161]. Vermehrte Hypoglykämieneigungen zeigten sich bei

gleichzeitiger Applikation mit Insulin oder oralen Antidiabetika wie beispielsweise

Glibenclamid [87]. Der Digoxin-Spiegel kann sich bei gleichzeitiger Gabe von Moxifloxacin

erhöhen [119].

1.6.1 Levofloxacin

Levofloxacin (LEV; Abb. 4) leitet sich von Ofloxacin ab. Ofloxacin liegt als Razemat vor.

Die linksdrehende Form hat die antibakteriellen Eigenschaften, die rechtsdrehende Form

(Dextrofloxacin) ist antibakteriell inaktiv, verursacht aber unerwünschte Wirkungen.

Levofloxacin ist nur die linksdrehende Form und kann daher höher dosiert werden [166].

Einleitung

12

N

O

O

F

N

COOH

CH3

N

H3C

Abbildung 4: Levofloxacin

� Pharmakokinetik

Levofloxacin hat eine Halbwertszeit von 7-8 h. Nach oraler Gabe von 0,25 g zeigen sich nach

1-2 h Serumspiegel von 2,5 bis 3 mg/l bzw. nach Gabe von 0,5 g Spiegel von 5 bis 6 mg/l.

Levofloxacin wird fast vollständig resorbiert. Die Plasmaeiweißbindung liegt bei 25%. Die

Ausscheidung erfolgt vorwiegend renal in aktiver Form, weshalb bei eingeschränkter

Nierenfunktion eine Dosisanpassung erfolgen sollte. Levofloxacin zeigt eine gute

Gewebepenetration, die Passage der Blut-Hirnschranke ist mäßig. Indikation und Schwere der

Erkrankung bestimmen Dosierung, Art und Dauer der Anwendung. In Deutschland ist

Levofloxacin als Tavanic® in 250 oder 500 mg Dosen zur oralen und intravenösen

Applikation erhältlich. Die maximale Tagesdosis beträgt 1000 mg (2 x 500 mg) zur Therapie

der ambulant erworbenen Pneumonie [12, 40, 166].

� Wirkspektrum

Das Wirkspektrum von Levofloxacin umfasst die meisten aeroben grampositiven und

gramnegativen Bakterien, wobei die Wirkung auf gramnegative Erreger insgesamt besser ist.

Levofloxacin erfasst auch P. aeruginosa. Zudem wirkt Levofloxacin gegen atypische Erreger

wie Legionellen oder Mycoplasmen. Verschiedene Clostridien- und Bacteroides-Arten sind

resistent. Insgesamt ist die Wirkung auf Anaerobier nur mäßig [79, 166].

� Unerwünschte Wirkungen

Als unerwünschte Wirkungen finden sich gastrointestinale Symptome wie Übelkeit,

Erbrechen, Diarrhoe oder abdominelle Schmerzen. Weiterhin können sich leichte

zentralnervöse Störungen wie Kopfschmerzen, Schwindel oder Schlafstörungen zeigen.

Selten treten schwere allergische Reaktionen oder arthropathische Beschwerden auf.

Vereinzelt wurden zudem Veränderungen des Blutbildes und Transaminansenanstiege

Einleitung

13

beschrieben. Nur selten wurden kardiotoxische Reaktionen (QT-Verlängerung) oder

phototoxische Reaktionen beschrieben [11, 79, 166].

� Indikationen und Kontraindiaktionen

Klassische Indikationen sind die bakterielle Sinusitis, exacerbierte chronische Bronchitis,

amulant erworbene Pneumonien (CAP), komplizierte Harnwegsinfektionen einschließlich

Pyelonephritis sowie Haut- und Weichgewebsinfektionen und Infektionen der Prostata.

Kontraindikationen bestehen bei Kindern, Schwangeren und Patienten mit Erkrankungen des

ZNS [12].

1.6.2 Moxifloxacin

Moxifloxacin (MOX; Abb. 5) ist in die Gruppe IV der Fluorchinolone eingeordnet. Durch

Einführung einer Methoxygruppe an Position 8, besitzt Moxifloxacin eine besonders hohe

Aktivität und geringe Phototoxizität [93].

N

O

COOHF

N

O

H3C

HN

H

H

Abbildung 5: Moxifloxacin

� Wirkspektrum

Moxifloxacin hat eine gute Wirksamkeit gegenüber Pneumokokken und fast allen anderen

Erregern von Atemwegsinfektionen einschließlich atypischer Erreger (Chlamydia spp., M.

pneumoniae und Legionella spp.). Zudem hat Moxifloxacin eine gute Aktivität gegen obligate

Anaerobier (B. fragilis, Bacteroides spp. und C. perfringens) [52, 63]. Gegenüber P.

aeruginosa ist Moxifloxacin nicht wirksam [25]. Häufig sind MRSA- und VRE-Stämme auch

gegenüber Moxifloxacin resistent [166].

Einleitung

14

� Pharmakokinetik

Nach Gabe von 0,4 g p.o. bzw. i.v. ergeben sich mittlere Serumspitzenspiegel von 3,2 mg/l

bzw. 4,4 mg/l. Die orale Bioverfügbarkeit beträgt 90%, die Einnahme kann unabhängig von

der Nahrungsaufnahme erfolgen. Die Halbwertszeit beträgt 12 h, die Plasmaeiweißbindung

wird mit durchschnittlich 40% angegeben. Aufgrund der langen Halbwertszeit wird

Moxifloxacin in Dosen von 400 mg nur einmal täglich oral oder intravenös appliziert [95,

166]. Mittels Mikrodialyse wiesen Müller et al. die gute Gewebegängigkeit von Moxifloxacin

und bevorzugte Verteilung im entzündeten Gewebe nach [117]. Experimentell passierte

Moxifloxacin bei eitriger Meningitis die Blut-Hirn-Schranke ausgezeichnet [139].

Moxifloxacin wird nach Biotransformation in Form einer Sulfo-Verbindung unverändert

renal und biliär ausgeschieden. Es kommt zu keiner Beeinflussung des CYP450-Systems. Bei

eingeschränkter Nierenfunktion muss keine Dosisanpassung erfolgen [40]. Moxifloxacin ist

in Deutschland als Avalox® 400 mg im Handel erhältlich [1].

� Unerwünschte Wirkungen

Als häufige unerwünschte Wirkungen treten gastrointestinale Symptome wie Übelkeit und

Erbrechen auf. Schwindel und Tremor wurden ebenfalls beschrieben. Im EKG können QT-

Verlängerungen auftreten. Es empfehlen sich daher regelmäßige EKG-Kontrollen unter der

Therapie mit Moxifloxacin [22, 166].

� Indikationen und Kontraindikationen

Zugelassene Einsatzgebiete in Deutschland sind die CAP sowie schwere Haut- oder

Weichgewebsinfektionen [1, 176]. In den USA besteht zusätzlich die Indikation zur Therapie

schwerer intraabdomineller Infektionen mit polymikrobiellem Keimspektrum und

Abzsessbildung [55]. In Deutschland ist die Therapie von Moxifloxacin bei

intraabdominellen Infektionen als Off-Label-Verordnung möglich [179]. Kontraindikationen

bestehen, wie auch bei Levofloxacin, bei Kindern, Schwangeren und Patienten mit

Erkrankungen des ZNS und zusätzlich bei bekanntem Long-QT-Syndrom [166].

Einleitung

15

1.7 Resistenzsituation, Formen und Mechanismen der Resistenz

Ein Bakterium ist resistent gegen ein Antibiotikum, wenn die MHK so hoch ist, dass auch bei

Verwendung der zugelassenen Höchstdosierung kein therapeutischer Erfolg zu erwarten ist

[6]. Es wird zwischen natürlicher (primärer) und erworbener (sekundärer) Resistenz

unterschieden. Die natürliche Resistenz beruht auf einer genetisch bedingten

Unempfindlichkeit der Bakterienart gegen das Antibiotikum. E. coli und andere gramnegative

Stäbchenbakterien haben eine natürliche Resistenz gegen Penicillin G, da das Antibiotikum

die Zellmembran nicht penetrieren kann. Die sekundäre Resistenz entsteht bei einer

empfindlichen Erregerart durch Selektion resistenter Stämme nach antibiotischer Einwirkung.

Die empfindlichen Bakterien der Population werden weiterhin abgetötet, während sich die

resistenten Erreger vermehren. Andererseits können durch Mutationen oder durch

Übertragung von genetischem Material resistente Bakterien entstehen, die unter Einwirkung

des Antibiotikums selektioniert werden. Spontane Chromosomenmutationen sind innerhalb

einer Bakterienpopulation selten. Da die Mutationen neben dem Resistenzerwerb auch häufig

zu Stoffwechselstörungen des Bakteriums führen, können sich die Bakterien häufig weniger

gut vermehren und die Resistenz kann nach Wegfall des Selektionsdrucks wieder

verschwinden. Der Mechanismus der übertragbaren Resistenz durch Plasmide besteht in der

Aufnahme resistenzkodierter extrachromosomaler DNA. Die plasmidvermittelte Resistenz

führt nicht zu Stoffwechselstörungen und hat damit eine größere praktische Bedeutung.

Folgende Resistenzmechanismen werden unterschieden [67, 74]:

� Bildung von inaktivierenden Enzymen: z. B. verursachen Betalaktamasen, welche den

Betalaktamring spalten, die Penicillinresistenz von Staphylococcus spp.

� Veränderung der Zielstrukturen: z. B. kann durch Alteration der A-Untereinheit der DNA-

Gyrase von E. coli die Fluorchinolon-Resistenz bedingt sein.

� Permeabilitätsbarriere: durch Änderung des D2-Porinkanals kann beispielsweise Imipenem

nicht durch die äußere Membran von P. aeruginosa eindringen.

� Aktiver Efflux: durch membranständige Effluxpumpen werden z. B. Tetrazykline schnell

aus Enterobakterien herausgepumpt und können somit keine Wirkung entfalten.

� Überproduktion des Zielmoleküls/Umgehungswege: z. B. kann durch Überexprimierung

des Zielmoleküls die erreichbare Konzentration der Folsäureantagonisten nicht ausreichen,

um eine vollständige Inhibition zu erreichen. Auch durch Aktivierung alternativer

Stoffwechselwege kann es zur Unwirksamkeit des Antibiotikums kommen.

Die Resistenz von Bakterien gegenüber den Fluorchinolonen wird durch Veränderungen der

Zielenzyme, aktiven Efflux oder reduzierte Permeabilität verursacht. Veränderungen der

Einleitung

16

Zielenzyme entstehen im Speziellen durch chromosomale Veränderungen der QRD-Regionen

(Quinolone resistance-determining regions, QRDR) der Gene, welche für die DNA-Gyrase

und Topoisomerase IV kodieren [20, 188]. Dabei führen Mutationen im gyrA- und gyrB-Gen

zur Fluorchinolon-Resistenz von gramnegativen Bakterien [164]. Insbesondere scheinen

Veränderungen im gyrA-Gen die Resistenzentstehung von obligaten Anaerobiern gegenüber

den Fluorchinolonen zu bedingen [147]. Mutationen im parC-Gen lassen sich in resistenten

grampositiven Bakterien inklusive S. aureus nachweisen [184]. Die Plasmid-vermittelte

Resistenz durch PMQR-Gene (Plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR) bei

gramnegativen Bakterien einschließlich E. coli ist eher von untergeordneter Bedeutung, da

niedrige Resistenzlevel resultieren [143]. Innerhalb des letzten Jahrzehnts ist es in

Deutschland zu einer deutlichen Zunahme von resistenten E. coli Stämmen gegenüber den

Fluorchinolonen gekommen. 1990 lag die Anzahl von Ciprofloxacin-resistenten E. coli

Stämmen unter 1%. 2007 stieg die Resistenzrate nach Angaben der Paul-Ehrlich-Gesellschaft

auf 26,4% [129]. Insgesamt ist in Deutschland der Verbrauch an Fluorchinolonen im

ambulanten und stationären Bereich innerhalb der letzten Jahre gestiegen. Im stationären

Sektor werden die Fluorchinolone nach den Betalaktamantibiotika am zweithäufigsten bei der

antimikrobiellen Therapie verwendet [10]. Nach Angaben der PEG ist ein hoher

Selektionsdruck aufgrund des steigenden Gebrauchs der Fluorchinolone für die steigenden

Resistenzraten verantwortlich.

In Tabelle 2 sind die Veränderungen in der Empfindlichkeit von E. coli in Deutschland in den

Jahren 2001 bis 2008 gegenüber ausgewählten Antibiotikagruppen nach Daten des European

Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) aufgelistet [37]. Steigende

Resistenzraten gegenüber den Fluorchinolonen können auch bei Bacteriodes spp. beobachtet

werden [61]. In Europa waren 9% der untersuchten Stämme (n = 1300) der B. fragilis Gruppe

resistent gegen Moxifloxacin. Außerdem waren 99% dieser Isolate resistent gegenüber

Ampicillin, wobei 96% dieser Stämme Betalaktamasen bildeten. Für Clindamycin wurden

ebenfalls steigende Resistenzraten bis 15% angegeben [72]. Gegenüber Metronidazol sind die

meisten obligaten Anaerobier weiterhin sensibel [134].

Einleitung

17

Tabelle 2: Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung von klinischen E. coli Isolaten (modifiziert nach Daten der EARSS[37], Grenzwerte nach EUCAST [8])

Antibiotikagruppe Empfindlichkeit 2001 (%) 2004 (%) 2007 (%) 2008 (%)

s 33,6 31,6 36,4 39,9

i 20,9 13,8 8,8 5,2 Amino- und

Acylamiopenicilline r 45,6 54,6 54,8 45,9

s 88,7 74,9 69,7 76,5

i 0,1 0,8 0,6 0,1 Fluorchinolone

i 11,2 24,3 29,7 23,4

s 99,0 97,4 91,7 94,7

i 0,3 0,7 0,6 0,4 Cepahlosporine

der 3. Generation r 0,1 1,9 7,7 4,8

1.8 Physiologische Bakterienflora des gastrointestinalen Trakts

Die Mukosa des gastrointestinalen Trakts beherbergt auf einer Oberfläche von 200-300 m2

insgesamt 1013-14 Bakterien aus bis zu 400 verschiedenen Spezies und Subspezies [69]. In der

Regel ist der Magen bis auf die transiente Flora durch Nahrung und Speichel oder

Helicobacter pylori in den Krypten steril. Im oberen Anteil des Dünndarms sind in der Regel

ebenfalls keine Bakterien zu finden. Nach distal kommt es zu einer Zunahme der

Bakterienzahl. Zunächst finden sich grampositive anaerobe Stäbchen und Fusobakterien mit

103-104 KBE/ml in kaudalen Dünndarmabschnitten [64, 74]. Im Kolon findet sich die höchste

Bakteriendichte mit bis zu 1012 Bakterien/g Fäzes, welches 60% der Stuhlmasse entspricht

[65].

Es wird zwischen luminaler und wandständiger Flora unterschieden. Die

Sauerstoffversorgung ist wandständig besser und das Verhältnis verschiebt sich zugunsten der

fakultativen Anaerobier mit adhäsiven Eigenschaften [67]. Es herrscht ein komplexes

Zusammenspiel des Gastrointestinums und der Standortflora [123]. Obligate Anaerobier sind

mit mehr als 99% Hauptbestandteil dieser Flora [177]. Tabelle 3 zeigt die Zusammensetzung

der Kolonflora.

Einleitung

18

Tabelle 3: Zusammensetzung der menschlichen Kolonflora [67]

Anaerobier (99%) Fakultative Anaerobier Transiente Flora

Bacteroides spp.

Bifidobakterien

Eubakterien

(insgesamt 75%)

Clostridien

anaerobe Kokken

Fusobakterien

Laktobazillen

(insgesamt 25%)

Enterobakterien

Enterokokken

Pseudomonas spp.

Hefen

Bacillus spp.

Protozoen

1.9 Epidemiologie, Klinik und Therapie von intraabdominellen Infektionen

Unter intraabdominellen Infektionen fasst man Infektionen der Bauchorgane, wie zum

Beispiel der Gallenwege und -gänge, der Appendix vermiformis, des Peritoneums und

intraabdominelle Abszesse zusammen. Diese Infektionen können traumatisch, infektiös,

postoperativ oder im Rahmen von Tumorerkrankungen entstehen. Bei der Peritonitis lassen

sich 4 Formen unterscheiden: spontan bakterielle Peritonitis (als primäre Form) bei Ascites,

sekundäre Formen, die tertiären Formen als Rezidivinfektionen und Abszesse und

nosokomniale Peritonitis als quartäre Form. Zudem gibt es die Pilzperitonitis und die

Peritonitis bei Peritonealdialyse als Sonderformen [96]. Die sekundäre Peritonitis stellt die

häufigste Form der intraabdominellen Infektion dar und entsteht durch die Ausbreitung von

Mikroorganismen aus dem Lumen der Hohlorgane [97]. Als Ursachen der sekundären

Peritonitis finden sich Appendizitis, Hohlorganperforation, ischämische Kolitis und

postoperative Infektionen. Die Kolondivertikulitis ist die häufigste Ursache einer Perforation

[107].

Die Peritonitis stellt sich klinisch als "akutes Abdomen" dar. Kujath und Rodloff [97]

definieren den Begriff präziser als "akuten, interventionsbedürftigen Abdominalbefund", der

einen akuten abdominellen Schmerz, einen Peritonismus und eine Kreislaufreaktion

insbesondere eine Schocksymptomatik verursacht. Zur Diagnostik gehören die klinische

Untersuchung, laborchemische Untersuchungen inklusive der Abnahme von Blutkulturen und

bildgebende Verfahren wie Abdomenübersichtsaufnahmen, computertomographische oder

sonographische Untersuchungen [97]. Charakteristische Symptome einer sekundären

Peritonitis sind Fieber, diffus abdomineller Schmerz, Übelkeit und Erbrechen. Bei der

klinischen Untersuchung sind eine lokale oder diffuse Abwehrspannung und verminderte bis

aufgehobene Darmgeräusche auffällig. Laborchemisch finden sich zumeist eine Leukozytose

und ein Anstieg des C-reaktiven Proteins (CRP) [71]. In einer klinischen Studie wurde die

durchschnittliche Letalität der intraabdominellen Infektionen mit 38% angegeben. Dabei war

Einleitung

19

die Sterblichkeitsrate bei der Appendizitis mit 10% am niedrigsten und mit 60% bei der

postoperativen Peritonitis am höchsten [76].

Die Keimbesiedlung bei intraabdominellen Infektionen ist meist polymikrobiell, bestehend

aus aeroben und anaeroben Bakterien [156, 181]. Die aeroben und anaeroben Bakterien

können in ihrer Pathogenität synergistisch wirken. Dabei beschreibt der bakterielle

Synergismus die Interaktion zwischen mindestens 2 verschiedenen Bakterienstämmen, die zu

einer Erhöhung des pathogenen Effekts führen. Ein einzelner Bakterienstamm würde diese

Wirkung nicht hervorrufen [110]. Durch tierexperimentelle Versuche konnte der

synergistische Effekt von E. coli und B. fragilis bezüglich der Abzessbildung und Letalität

gezeigt werden [125, 138]. Die Art des Synergismus scheint abhängig von der Größe des E.

coli Inokulum zu sein. Hohe E. coli Inokula in Mischkultur mit B. fragilis verursachen

synergistische Letalität und niedrige Inokula von E. coli Bakterien führen zur Abzessbildung

[140]. Frühere Untersuchungen unterstützen die Hypothese, dass ein Erreger direkt das

Wachstum eines anderen anwesenden Erregers durch beispielsweise Produktion von

Wachstumsfaktoren bedingt [49]. Der Verlauf dieser Mischinfektionen ist biphasisch mit

initial diffuser Infektion und anschließender Abzessbildung [62, 174]. Es scheint zunächst zur

Vermehrung der falkultativ anaeroben Keime zu kommen. Durch den Verbrauch von

Sauerstoff wird das Redoxpotential reduziert. Dadurch entsteht ein Mileu, welches für die

Vermehrung der obligaten Anaerobier optimal ist. Nach ungefähr 20 Stunden sind diese

Anaerobier die prädominanten Keime [148]. Einige Bakterienarten wirken zudem

immunmodulierend [29, 110, 141]. In verschiedenen in vitro und in vivo Studien konnte eine

Beeinträchtigung der Phagozytosefähigkeit durch Leukozyten oder Makrophagen nach

Kontakt mit Bacteroides spp. nachgewiesen werden [82, 90, 137].

1926 stellte Martin Kirschner die noch heute gültigen Richtlinien zur chirurgischen Therapie

der sekundären Peritonitis auf. Die Behandlung erfordert nach heutigem Maßstab neben dem

chirurgischen Eingriff eine antimikrobielle Therapie sowie die intensivmedizinische

Betreuung. 2003 wurden von der IDSA, der SIS, der amerikanischen Society of Microbiology

und der Society of Infectious Disease of Pharmacists evidenzbasierte Richtlinien zur

antibiotischen Therapie von intraabdominellen Infektionen herausgegeben. Auf Basis dieser

Richtlinien wurde 2004 durch Vogel, Bodmann und eine Expertengruppe der PEG eine

entsprechende Empfehlung der Peritonitis-Therapie herausgegeben. Tabelle 4 zeigt eine

Auflistung der möglichen antibiotischen Initialtherapie der sekundären Peritonitis nach der

durch Bodmann et al. im Jahr 2010 aktualisierten Empfehlung [27]. Die verschiedenen

antibiotischen Regimes sind in ihrer Wirkintensität ähnlich und keines der genannten Regime

Einleitung

20

konnte in Untersuchungen als über- oder unterlegen herausgestellt werden [107, 135, 156,

178]. Der behandelnde Arzt sollte sich ungeachtet der Empfehlungen zur antibiotischen

Therapie durch Fachgesellschaften immer auch nach dem aktuellen Wissensstand und neuen

Erkenntnissen richten. Beispielsweise wurden 2011 die Anwendungsgebiete für Tigecyclin

aufgrund erhöhter Letalität in klinischen Studien stark eingeschränkt [132].

Tabelle 4: Empfehlungen zur Initialtherapie der verschiedenen Formen der sekundären Peritonitis (modifiziert nach Bodmann et al., 2010 [27])

Infektion Initialtherapie

lokale sekundäre Peritonitis

(z. B. frisch perforierte

Appendizitis)

Cephalosporin Gruppe 2/3a + Metronidazol

Acylaminopenicillin/Betalaktamaseinhibitor

Aminopenicillin/Betalaktamaseinhibitor

Fluorchinolon Gruppe II + Metronidazol

Carbapenem Gruppe 2

diffuse sekundäre Peritonitis

(z. B. perforierte

Sigmadivertikulitis)

Acylaminopenicillin/Betalaktamaseinhibitor

Cephalosporin Guppe 3a/4 + Metronidazol oder

Fluorchinolon Gruppe II/III + Metronidazol

Carbapenem Gruppe 1

Carbapenem Gruppe 2

Fluorchinolon Gruppe IV

Tigecyclin

postoperative Peritonitis

(z. B.

Anastomoseninsuffizienz

nach Rektumresektion)

Carbapenem Gruppe 1

Carbapenem Gruppe 2

Acylaminopenicillin/Betalaktamaseinhibitor

Fluorchinolon Gruppe IV

Tigecyclin + ggf. Pseudomonas-wirksamer Substanz

Die Dauer der Therapie richtet sich nach der zu Grunde liegenden Genese der

intraabdominellen Infektion, insbesondere der sekundären Peritonitis. Allgemein wird

empfohlen, die Therapie bis zur klinischen und paraklinischen Normalisierung der Infektion

und Infektionsparameter fortzusetzen, wobei die Dauer der Therapie bis zu 14 Tagen betragen

sollte [96, 166]. Bei den intraabdominellen Infektionen werden E. coli und B. fragilis als

häufigste Erreger isoliert [30, 111, 180].

Einleitung

21

1.10 E. coli - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger

E. coli aus der Familie der Enterobacteriaceae ist ein fakultativ anaerobes, gramnegatives,

peritrich begeißeltes, nicht sporenbildendes Stäbchenbakterium. 1885 wurde es erstmals von

Theodor Escherich beschrieben. Als natürliches Reservoir dienen der menschliche und

tierische Gastrointestinaltrakt. E. coli ist überwiegend laktose-positiv, katalase-positiv und

oxidase-negativ. Laktose-negative E. coli Bakterien lassen sich auch nachweisen. Es werden

mehr als 700 verschiedenen Serotypen nach Oberflächen (O)-, Kapsel (K)- und Geißel (H)-

Antigenen unterschieden. Das O-Antigen (O-spezifische Polysaccharidkette) gehört zum

Lipopolysaccharid (LPS, Endotoxin), welches Bestandteil der Zellwand dieser gramnegativen

Bakterien ist. Lipoid A, ebenfalls Bestandteil des LPS, ist nach dem Zerfall der

Bakterienzelle für die toxische Wirkung der E. coli Bakterien verantwortlich. Durch

Bekapselung des Bakteriums besteht Schutz vor Phagozytose. Diese Antigene sind neben

Adhäsinen, Invasinen und genetischen Eigenschaften wichtige Virulenzfaktoren von E. coli.

Besondere Bedeutung kommt dabei dem K1-Antigen von E. coli zu. Mittels kultureller

Anzucht und biochemischer Identifikation ("Bunte Reihe") erfolgt die Labordiagnostik [7, 67,

74]. E. coli dient zudem als Indikator für fäkale Verunreinigung und wird häufig in der

Molekularbiologie sowie als Wirt für Klonierungsvektoren in der Bio- und Gentechnologie

verwendet [7]. Die Gattung E. coli kann in obligat und fakultativ pathogene E. coli eingeteilt

werden. Die obligat pathogenen E. coli Stämme verursachen exogen intestinale Infektionen

und lassen sich in 5 Gruppen nach verursachender Erkrankung einteilen, wie in Tabelle 5

aufgeführt [174].

Tabelle 5: Obligat pathogene E. coli Stämme und ausgelöste Erkrankung (modifiziert nach Theuretzbacher, 1999 [174])

Darmpathogene E. coli Stämme Erkrankung

EPEC (enteropathogener E. coli ) Säuglingsenteritis

ETEC (enterotoxischer E. coli ) Reisediarrhoe

EIEC (enteroinvasiver E. coli ) ruhrähnliche Erkrankung

EHEC (enterohämorrhagischer E. coli ) Diarrhoe, HUS

EAEC (enteroaggreggativer E. coli ) peristierende Enteritis

Fakultativ pathogene E. coli sind Teil der physiologischen Standortflora, wo sie

üblicherweise keine Infektionen verursachen. Erst durch Verschleppung oder Absiedlung in

andere Körperregionen kommt es zu extraintestinalen Infektionen wie urogenitalen

Einleitung

22

Infektionen, nosokomialen Infektionen, intraabdominellen Infektionen und Sepsis. Zudem

kann E. coli Pneumonien verursachen, welche meist nach Aspiration oder

beatmungsassoziiert auftreten [18, 142, 172]. E. coli ist ein häufiger Erreger der

Neugeborenen-Meningitis, welche weltweit jährlich ungefähr 50000 Todesfälle fordert. In

80% der isolierten Erreger lässt sich dabei das K1-Antigen nachweisen, welches für die

Passage der Blut-Hirn-Schranke wichtig ist [91, 92]. Einige E. coli Stämme verfügen über

Fimbrien. Dadurch können sie am Urothel haften und so aufgrund von Schmierinfektionen

aus der Analregion bei Frauen häufig zu Harnwegsinfekten führen [74]. Die Differenzierung

der Fimbrien erfolgt über eine Hämagglutinationsreaktion mit Mannose. Typ 1 Fimbrien sind

Mannose-sensibel (Hemmung der Hämagglutination durch Mannose) und verursachen

Infektionen der unteren Harnwege und Typ 2 Fimbrien sind Mannose-resistent und bedingen

Pyelonephritiden [7]. E. coli ist häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen und zudem für

15% der nosokomialen Bakteriämien verantwortlich [10].

1.11 B. fragilis - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger

B. fragilis ist ein obligat anaerobes, gramnegatives, nicht sporenbildendes, teilweise

bekapseltes und begeißeltes Stäbchen. B. fragilis gehört zur Familie der Bacteroidaceae.

Diese Familien ist sehr heterogen und in Gattungen und Arten unterteilt [2]. Die wichtigsten

Vertreter sind Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyrommonas spp. und Fusobacterium

spp. Tabelle 6 enthält eine Auflistung der Bacteroides Gattung und Arten [182].

Tabelle 6: Bacteroides Gattung und Arten (modifiziert nach Wexler, 2007 [182])

Gattung Art

Bacteroides acidifaciens, caccae, coprocola, coprosuis, distasonis, dorei, eggerthii,

finegoldii, fragilis , goldsteinii, helcogenes, johnsonii, intestinalis,

massiliensis, merdae, nordii, ovatus, plebeius, pyogenes, salyersai,

stercoris, thetaiotaomicron, uniformis, vulgatus

Die Bacteroides Gattung stellt mengenmäßig den größten Teil der physiologischen

Bakterienflora von Mensch und Tier dar. Allerdings stellt B. fragilis nur 0,5% der Flora im

Kolon dar [62]. B. caccae, B. distasonis, B. eggerthii, B. fragilis , B. merdae, B. ovatus, B.

stercoris, B. thetaiotaomicron, B. uniformis und B. vulgatus werden im klassischen Sinn zu

der sogenannten B. fragilis Gruppe gezählt. B. capillosus, B. coagulans, B. putredinis, B.

Einleitung

23

pyogenesa, B. tectus, B. splanchnicus, B. tectusa, B. tectum und B. ureolyticus gehören zur

non-B. fragilis Gruppe [83].

Die Lipopolysaccharide der Zellwand von Bacteroides spp. wirken weniger toxisch, da sie

sich in ihrem Aufbau erheblich von denen der Enterobakterien unterscheiden [67]. Als

Virulenzfaktoren lassen sich bei Bacteroides spp. Kapselpolysaccharide nachweisen, welche

die Abszessbildung begünstigen. Unbekapselte Bacteroides Stämme benötigen zur

Abszessbildung die Anwesenheit eines aeroben Erregers [125, 126]. Bacteroides spp. haben

für den Menschen wichtige Eigenschaften. Sie produzieren beispielsweise Glucuronidasen,

welche für den enterohepatischen Kreislauf unerlässlich sind und Butyrat zur

Enterozytenernährung. Durch die Kolonisation von Haut und Schleimhäuten scheinen die

Bakterien der Ansiedlung von pathogenen Mikroorganismen vorzubeugen, was als

"Kolonisationsresistenz" bezeichnet wird [67]. Der Nachweis der Erreger erfolgt durch

Anzucht und die Identifizierung mittels biochemischer Untersuchungen. Bei Verdacht auf

eine Anaerobierinfektion sollte die Abnahme der Probe möglichst mittels Punktion oder

intraoperativ erfolgen. Der Transport in einem geeigneten Medium sollte zügig erfolgen

[148]. B. fragilis ist ein fakultativ pathogener Erreger. Der klinische Verlauf dieser

Infektionen ist selten akut. Es überwiegen subakute und chronische Verlaufformen. Als

Ursprungsorte für eine Anaerobierinfektion finden sich gastrointestinaler und urogenitaler

Trakt sowie die Mundhöhle [74]. Es kommen Infektionen des ZNS, des Urogenital- und

Abdominalsystems sowie den Respirationstraktes vor. Dabei kann die oropharyngeale Flora

Ursache für pulmonale Infektionen mit obligaten Anaerobiern sein. Meist handelt es sich

auch hier um Mischinfektionen, welche nach Aspirationen auftreten und zu Pneumonien,

Abszessen und Empyemen führen können [28, 109]. B. fragilis ist unter den obligaten

Anaerobiern hauptverantwortlich für die Abszessbildung und Bakteriämie [88]. Bei einer B.

fragilis Bakteriämie liegt die Letalität zwischen 20 und 31% [34]. In der Geburtsmedizin ist

die Puerpuralsepsis durch B. fragilis bei einem vorzeitigen Blasensprung gefürchtet [166].

Zielstellung

24

2 Zielstellung Intraabdominelle Infektionen sind häufig bakterielle Mischinfektionen. Dabei ist die

sekundäre Peritonitis die häufigste Form. E. coli und B. fragilis werden bei diesen

polymikrobiellen Infektionen am häufigsten isoliert. Die Therapie erfordert neben der primär

chirurgischen Versorgung eine antibiotische Therapie. Dabei basiert die möglichst

zielgerechte antibiotische Therapie auf Daten von Empfindlichkeitstestungen. Die

Bestimmung der MHK liefert Hinweise zur Empfindlichkeit der Erreger, wodurch Aussagen

über eine wahrscheinliche Wirkung in vivo gemacht werden können. Die klinische Einstufung

in die Grenzwerte "sensibel", "intermediär" und "resistent" schließt aber noch weitere

Faktoren wie Dosierung, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik sowie Ergebnisse aus in vitro

und in vivo Studien mit ein. Die Ergebnisse von Untersuchungen mittels PK/PD-Modellen

gehen unter anderem in die Bewertung von Grenzwerten ein. Sie erlauben zudem einen

Vergleich der antimikrobiellen Effekte von verschiedenen Antibiotika einer als auch

unterschiedlicher Substanzklassen.

In der vorliegenden Arbeit wird mittels eines in vitro PK/PD-Modells die Aktivität von

Levofloxacin und Moxifloxacin in Mono- und Mischkulturen gegenüber B. fragilis und E.

coli untersucht. Hierdurch sollen sich Hinweise über die Aktivität von Levofloxacin und

Moxifloxacin in Mischinfektionen wie beispielsweise intraabdominellen Infektionen ergeben

und es soll abgeleitet werden, ob sich Unterschiede der antibakteriellen Aktivität gegenüber

E. coli Stämmen unter aeroben im Vergleich mit anaeroben Bedingungen ergeben. Des

Weiteren werden PK/PD-Indizes für Levofloxacin und Moxifloxacin berechnet. Diese Werte

werden dann in Abhängigkeit mit den Ergebnissen der Untersuchung für Mono- und

Mischkulturen bewertet.

Durch die vorliegende Arbeit lassen sich Aussagen treffen, ob die MHK-Bestimmung mit

Bewertung als Therapieempfehlung bei Mischinfektionen ausreichend ist oder ob bei

polymikrobiellen Infektionen weitergehende Untersuchungen für die Therapieempfehlungen

notwendig sind.

Materialien

25

3 Material

3.1 Geräte und Arbeitsplatz

Anaerobier-Werkbank mit Brutschrank HEAREUS, Hanau, Deutschland

Beleuchtung HEAREUS, Hanau, Deutschland

Brutschrank WTB BINDER LABORTECHNIK GmbH,

Tuttlingen, Deutschland

Gefrierschrank (-80 °C) HEAREUS, Hanau, Deutschland

Kühlschrank (-20 °C) LIEBHERR, Bulle, Schweiz

Membran-Vakuumpumpe VACUUBRAND GmbH & CO.,

Wertheim, Deutschland

Werkbank HEAREUS, Hanau, Deutschland

Resazurin-Anaerobier-Indikator (The

Anaerobic Indicator)

OXOID Ltd., Basingstoke, Hampshire, GB

Ultrospec 2000 (Photometer) PHARMACIA BIOTECH, Cambridge, GB

Die anaerobe Atmosphäre in der Anaerobierwerkbank bestand aus einem Gemisch von 80%

N2, 15% CO2 und 5% H2. Mittels eines Palladiumkatalysators wurde eventuell vorhandener

Restsauerstoff zu Wasser reduziert. Durch einen Resazurin-Anaerobier-Indikator wurde die

anaerobe Atmosphäre während jeder Versuchsdurchführung überprüft.

3.2 Laborbedarf

Drygalski-Spatel, steril MERCK, Darmstadt, Deutschland

Eppendorfgefäß (1,5 ml), steril SARSTEDT, Nürnbrecht, Deutschland

Eppendorfpipette EPPENDORF, Hamburg, Deutschland

Erlenmeyerkolben (300 ml), steril SCHOTT - Duran, Mainz, Deutschland

Handschuhe Peha - soft HARTMANN, Heidenheim, Deutschland

Impfschlingen, blau, steril SARSTEDT, Nürnbrecht, Deutschland

Küvetten ( 10 × 10 × 45 mm) GREINER Bio – One GmbH,

Kremsmünster, Österreich

Levofloxacin (LEV) SANOFI-AVENTIS, Frankfurt, Deutschland

Moxifloxacin (MOX) BAYER-SCHERING PHARMA, Leverkusen,

Deutschland

Materialien

26

Pipettenspitzen (10 µl, 100 µl, 1000 µl), steril SARSTEDT, Nürnbrecht, Deutschland

Pipetus-akku ( Pipettierhilfe) HIRSCHMANN LABORGERÄTE

Gmbh & CO. KG, Heilbronn, Deutschland

Serologische Pipette (10 ml, 25 ml, 50 ml),

steril

SARSTEDT, Nürnbrecht, Deutschland

Röhrchen (13 ml, 50 ml), steril SARSTEDT, Nürnbrecht, Deutschland

Vortexer JANKE & KUNKEL GmbH & CO. KG,

Staufen, Deutschland

Waage SARTORIUS, Göttingen, Deutschland

Wattestab, steril Dr. ILONA SCHUBERT,

Laborfachhandel, Pötzschau, Deutschland

3.3 Nährmedien zur Anzucht der verwendeten Bakterienkulturen und

Bakteriensuspensionen sowie Materialien zur Bestimmung der MHK

Brucella-Bouillon

BECTON Dickinson, Heidelberg,

Deutschland

Columbia-Agar OXOID Ltd., Basingstoke, Hamsphire, GB

Endo-Agar BIOMERIEUX, Marcy l´Étoile, Frankreich

Levofloxacin- und Moxifloxacin-

Etest-Streifen

BIOMERIEUX, Marcy l´Étoile, Frankreich

Gentamicin

MERCKLE GmbH, Blaubeuren,

Deutschland

Hämin

SERVA Feinbiochemica, Heidelberg,

Deutschland

Magermilchpulver OXOID Ltd., Basingstoke, Hamsphire, GB

Müller-Hinton-Agar BECTON, Dickinson and Company, Sparks,

USA, Le Pont de Claix, Frankreich

NaHCO3

MERCK EUROLAB GmbH, Darmstadt,

Deutschland

Schafblut, defibriniert OXOID GmbH, Wesel, Deutschland

Vitamin K1

SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland

Materialien

27

Um ein optimales Nährmedium für die Anzucht der Anaerobier zu haben, wurden 2 l

Columbia-Agar mit 100 ml Schafblut, 1 mg/l Vitamin K1, 5 mg/l Hämin und 1 ml/l 0,1%

NaHCO3 supplementiert.

Für die Herstellung des Columbia-Gentamicin-Agar wurden zu 2 l supplementierten,

autoklavierten und auf 50 °C abgekühlten Columbia-Agar 80 mg Gentamicin zugegeben. Das

Agarpulver wurde nach Angaben des Herstellers in der jeweils vorgeschriebenen Menge

destilliertem Wasser gelöst und für 15 min bei einer Temperatur von 121 °C autoklaviert.

Anschließend wurde der flüssige Agar auf etwa 50 °C abgekühlt und das Flüssigmedium in

Portionen zu je 20 ml unter sterilen Bedingungen in Kunststoffpetrischalen gegossen.

2 l Brucella-Bouillon wurden mit 1 mg/l Vitamin K1, 5 mg/l Hämin und 1 ml/l 0,1% NaHCO3

supplementiert.

Im Weiteren werden die genannten supplementierten Nährmedien nur noch als

supplementierter Columbia-Agar, supplementierter Columbia-Gentamicin-Agar und

supplementierte Brucella-Bouillon bezeichnet.

Methoden

28

4 Methoden

4.1 Untersuchte Bakterienstämme

Für die Versuche wurden B. fragilis und E. coli Stämme aus der Stammsammlung des

Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Universität Leipzig verwandt. Bei den in Tabelle

7 aufgeführten Bakterienstämmen handelt es sich um Isolate von Patientenproben und einen

Referenzstamm. Die Isolate werden in Magermilch bei -80 °C gelagert.

Tabelle 7: Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft

Bakterienstamm Herkunft

E. coli ATCC 25922 Referenzstamm

E. coli VA 4050 Klinisches Isolat aus Rachenabstrich, Zustand nach

Herztransplantation

E. coli BK 12944 Klinisches Isolat aus Blutkultur,

hämatologisch/onkologische Erkrankung

E. coli VA 6886 Klinisches Isolat aus Gallenflüssigkeit, Klatskin-

Carcinom

B. fragilis RMA 6791 Klinisches Isolat aus Blutkultur

B. fragilis WAL R 13267 Klinisches Isolat, Entnahmeort unbekannt

B. fragilis RMA 5120 Klinisches Isolat aus Appendix vermiformis,

Appendizitis

B. fragilis RMA 0309 Klinisches Isolat aus Abdomen

Die Stämme mit der Bezeichnung RMA wurden freundlicherweise von E. J. C. Goldstein, R.

M. Alden Research Laboratory, Santa Monica, Kalifornien, USA, zur Verfügung gestellt.

Der WAL R 13267 Stamm stammt aus einer internationalen klinischen Anaerobierstudie. Bei

den E. coli Stämmen handelt es sich um einen Referenzstamm (E. coli ATCC 25922) sowie

klinische Isolate aus Patientenproben des Institutes für Medizinische Mikrobiologie der

Universität Leipzig.

4.2 Anzucht der Bakterienkulturen

Zur Anzucht der Bakterienstämme wurden für die E. coli Stämme Endo-Agar und für die B.

fragilis Stämme supplementierter Columbia-Agar verwendet. Die Bakterien wurden aus der

Methoden

29

gefrorenen Magermilchlösung mit einer sterilen Impfschlinge auf das entsprechende

Agarmedium übertragen. Die E. coli Stämme wurden für 24 h aerob auf Endo-Agar bebrütet.

Die B. fragilis Stämme wurden für 48 h unter anaeroben Bedingungen auf supplementiertem

Columbia-Agar bebrütet. Zur Kontrolle wurde beimpfter Agar aerob bebrütet.

4.3 Untersuchung zur Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf

supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agar

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen mit B. fragilis und E. coli Stämmen sowohl in

Mono- als auch in Mischkulturen durchgeführt.

Bei den Mischkulturen wuchsen sowohl B. fragilis und E. coli Kolonien gemeinsam auf dem

supplementierten Columbia-Agarmedium. Um die Ergebnisse besser auswerten zu können,

wurde eine mögliche Wachtumsunterdrückung der E. coli Kolonien auf supplementiertem

Columbia-Gentamicin-Agar untersucht. Es wurden Inokula aus E. coli und B. fragilis

Stämmen hergestellt und dann zu den verschiedenen Zeitpunkten 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 h auf

den Columbia-Gentamicin-Agarmedium und den Columbia-Agarmedium ausgestrichen und

für 48 h anaerob inkubiert.

4.4 Bestimmung der MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin

Die MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin der untersuchten Bakterienstämme wurde mit

dem Etest nach Angaben des Herstellers bestimmt.

Es wurden 2-3 Bakterienkolonien vom jeweiligen Agarmedium in 10 ml präreduzierte,

supplementierte Brucella-Bouillon abgeimpft. Die Suspension mit den E. coli Stämmen

wurde für 24 h aerob bei 37 °C inkubiert. Bei den B. fragilis Stämmen erfolgte die

Durchführung unter anaeroben Bedingungen mit einer Inkubationszeit von 48 h bei einer

Temperatur von 37 °C.

Nach der Bebrütung wurde für das B. fragilis Inokulum ein McFarland Standardwert 1

eingestellt, welcher einer Bakteriendichte von 3 × 108 KBE/ml entspricht. Für das E. coli

Inokulum erfolgte nach Einstellung von McFarland 1 eine 20-fache Verdünnung. Die

Beimpfung erfolgte mittels eines sterilen Wattetupfers. Dabei wurde die gesamte Oberfläche

des Agarmediums in drei Richtungen gleichmäßig ausgestrichen. Für die Etest®-Versuche der

E. coli Stämme wurde Müller-Hinton-Agar und für die B. fragilis Stämme supplementierter

Columbia-Agar verwendet, wobei eine Präreduktion des Agarmediums von ungefähr drei

Stunden erfolgte. Die Etest-Streifen von Levofloxacin und Moxifloxacin wurden danach

Methoden

30

blasenfrei und zentral mittels einer Pinzette auf das Agarmedium aufgebracht. Die Ablesung

erfolgte bei den E. coli Stämmen nach 24 h aerober Inkubation und bei den B. fragilis

Stämmen nach 48 h anaerober Inkubation bei 37 °C. Am Schnittpunkt des Hemmhofes mit

dem Teststreifen konnte die minimale Hemmkonzentration abgelesen werden.

4.5 PK/PD-Untersuchung von Levofloxacin und Moxifloxacin

Ein Dosierungsintervall bei der Gabe einer bestimmten antibiotischen Dosis pro Tag ist

Grundlage der zeitlichen Durchführung des Versuches, da dieses Intervall abhängig von der

Halbwertszeit der jeweiligen Substanz ist. Die durchschnittlichen Dosiswerte sind nach Stille

et al. [166] in Tabelle 8 aufgelistet und beziehen sich auf eine normalgewichtige,

nierengesunde Person (ca. 75 kg Körpergewicht).

Tabelle 8: Tagesdosis und Dosierungshäufigkeit der Antibiotika (nach Stille et al. [166])

Antibiotika Tagesdosis und Dosierungshäufigkeit/Tag

Levofloxacin 1 bis 2 × täglich 0,25-0,5 g p.o. oder i.v. als Kurzinfusion

Moxifloxacin 1 × täglich 0,4 g p.o. oder i.v. als Kurzinfusion

Tabelle 9 zeigt eine Auflistung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Antibiotika nach

Werten von Stille et al. sowie der Versuchsdauer im in vitro PK/PD-Modell [166].

Tabelle 9: Pharmakokinetische Eigenschaften der Antibiotika nach Stille et al. [166] und Versuchsdauer im in vitro PK/PD-Modell

Antibiotikum i.v. Gabe von Cmax (mg/l) t ½ e (h) Versuchsdauer (h)

Levofloxacin 0,5 g in 60 min 6,2 7-8 13

Moxifloxacin 0,4 g in 30 min 4,4 12 12

Die Halbwertszeit von Moxifloxacin entspricht der Versuchsdauer. Trotz der kürzeren

Halbwertszeit von Levofloxacin wurde zur besseren Vergleichbarkeit eine ähnlich lange

Versuchsdauer wie bei Moxifloxacin gewählt. Die Plasmakonzentration des entsprechenden

Antibiotikums über die Zeit gesehen, ist abhängig von der Eliminationshalbwertszeit und

ändert sich nach folgender Formel [119]:

Ct = C0 × e – k × t

C0 = Ausgangskonzentration zum Zeitpunkt t = 0 (mg/l)

Ct = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt t (mg/l)

Methoden

31

k = Eliminationskonstante

k = ln2 / t ½ e

t ½ e = Eliminationshalbwertszeit

Das in Abbildung 6 dargestellte Konzentrations-Zeit-Diagramm zeigt einen linearen Abfall

der Konzentration über die jeweilige Versuchsdauer von 13 h für Levofloxacin und 12 h für

Moxifloxacin.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0 2 4 6 8 10 12

Zeit (h)

Kon

zen

tra

tion

(m

g/l)

Moxifloxacin

Levofloxacin

Abbildung 6: Konzentrations-Zeit-Diagramm als Exponentialfunktion Aus Gründen der Praktikabilität wurde der Versuch nach dem in Abbildung 7 dargestellten

stufenförmigen Konzentrations-Zeit-Diagramm durchgeführt.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0 2 4 6 8 10 12 14

Zeit (h)

Ko

nze

ntra

tion

(mg/

l)

Levofloxacin

Moxifloxacin

Abbildung 7: Stufenförmiges Konzentrations-Zeit-Diagramm im Versuch

Methoden

32

Durch entsprechende Verdünnung des Ansatzes über die Zeit wurde der Konzentrationsabfall

im in vitro PK/PD-Modell erreicht. Um die nächste Konzentrationsstufe entsprechend der

Eliminationshalbwertszeit der Antibiotika zu erreichen, wurde das Inokulum verdünnt

(Tabellen 18 und 19 im Anhang 1 und 2). Aus Gründen der Praktikabilität wurde

halbstündlich verdünnt. Für die Berechnung des jeweiligen Zugabevolumens wurde folgende

Formel verwendet:

VZU = [(VSL × CSL) / C] - VSL

VZU = zuzugebendes Volumen (ml)

VSL = eingesetztes Volumen der Stammlösung (ml)

C SL = Konzentration der Stammlösung (mg/l)

C = benötigte Konzentration (mg/l)

4.6 Herstellung der Antibiotikasuspensionen

Unter Berücksichtigung der in Tabelle 9 aufgeführten maximal erreichbaren

Plasmakonzentrationen von Levofloxacin und Moxifloxacin erfolgte die Berechnung der

Volumina für die Versuche mit den entsprechend verifizierten Antibiotikumkonzentrationen,

welche in Tabelle 10 aufgeführt sind. Die maximalen Plasmakonzentrationen wurden den

totalen Konzentrationen gleichgesetzt, da die Proteinbindung keine wesentliche

Berücksichtigung findet. Wolfson et al. konnten bei den Fluorchinolonen nur minimale

Unterschiede bei der MHK-Bestimmung in den Testmedien mit Serum im Vergleich zu

serumfreien Medien feststellen [186]. Fuhst et al. kamen zum Schluss, dass eine

Plasmaproteinbindung unter 80% die Wirkung eines Antibiotikums nicht beeinflusst. Unter

anderem konnte für Moxifloxacin gezeigt werden, dass die Wirkung der Gesamtdosis mit

Albumin identisch mit der Wirkung der berechneten freien Fraktion ist [60].

Tabelle 10: Konzentrationen der Inokulavolumen zur Herstellung der Antibiotikumsuspensionen

Antibiotikum

Konzentration im

Inokulumvolumen

(mg/l)

Lösungsmittel

Levofloxacin 60 Aqua dest.

Moxifloxacin 40 Aqua dest.

Methoden

33

Nach der Herstellung wurden die Antibiotikasuspensionen in Fraktionen zu je 1 ml aufgeteilt

und bei -80 °C tiefgefroren, um einen Aktivitätsverlust zu vermeiden.

4.6.1 Herstellung der Inokula für die Versuche Die bei der Herstellung der Inokula und im Versuch benötigte supplementierte Brucella-

Bouillon wurde immer aerob und anaerob bei 37 °C für 24 h vor Versuchsbeginn inkubiert,

um Verunreinigungen während der einzelnen Versuchsphasen auszuschließen.

Die im Versuch verwendeten supplementierten Columbia- und Columbia-Gentamicin-

Agarmedien wurden vor Versuchsbeginn für 2-3 h, die supplementierte Brucella-Bouillon für

24 h bei 37 °C in anaerober Atmosphäre präreduziert. Die Endo-Agarmedien der

Monokulturversuche wurden für 2-3 h vor Versuchsbeginn in einer aeroben Atmosphäre im

Brutschrank bei einer Temperatur von 37 °C belassen.

Für die Herstellung der Inokula wurde Endo-Agar mit den jeweiligen E. coli Stämmen unter

aeroben Bedingungen beimpft, ausgestrichen und für 24 h aerob bei 37 °C inkubiert. Für die

B. fragilis Stämme wurde supplementierter Columbia-Agar verwendet und im anaeroben

Milieu 48 h bei 37 °C inkubiert. Nach der entsprechenden Inkubationszeit wurde von den

bebrüteten Medien eine Kolonie des jeweiligen E. coli Stammes unter aeroben Bedingungen

und je eine Kolonie der B. fragilis Stämme vom entsprechenden Agarmedium unter

anaeroben Bedingungen mit einer sterilen Öse abgenommen. Diese gewonnenen Kolonien

wurden in 10 ml supplementierte Brucella-Bouillon abgeimpft. Die Bouillon mit den E. coli

Stämmen wurde 24 h aerob und die Bouillon mit den B. fragilis Stämmen 48 h anaerob bei 37

°C inkubiert. Mittels Spektrophotometer wurden die in Tabelle 11 aufgeführten

Bakteriendichten bestimmt und verdünnt, um die entsprechenden McFarland-Standards zu

erhalten.

Tabelle 11: McFarland Standard und entsprechende Bakteriendichte der verwendeten Bakterien

Bakterien Bakteriendichte (KBE/ml) McFarland Standard

B. fragilis 1,2 × 109 (entsprechend 2,4 × 108 im Inokulum) 4

E. coli 1,5 × 108 (entsprechend 3 × 107 im Inokulum) 0,5

Zu jedem Inokulum mit Antibiotikum wurde eine Kontrollkultur ohne Antibioitkum

mitgeführt. Das fehlende Antibiotikumvolumen wurde durch äquivalente Mengen

Methoden

34

supplementierter Brucella-Bouillon ergänzt. Die Ansätze wurden in sterile Röhrchen

pipettiert.

Die Vorbereitung und Versuchsdurchführung mit B. fragilis Monokulturen und

Mischkulturen erfolgten in anaerober Atmosphäre. Die Versuchsvorbereitung und

Versuchsdurchführung mit E. coli Monokulturen wurden sowohl aerob, als auch anaerob

durchgeführt. Tabellen 12 und 13 zeigen die Zusammensetzung der Versuchsinokula für

Mono- und Mischkulturen.

Tabelle 12: Pipettierschema für die Versuchsreihe mit Levofloxacin

Monokulturen

E. coli B. fragilis Mischkulturen

LEV+ LEV- LEV+ LEV- LEV+ LEV-

Brucella-Bouillon (ml) 7 8 7 8 5 6

E. coli-Suspension (ml) 2 2 0 0 2 2

B. fragilis-Suspension (ml) 0 0 2 2 2 2

Antibiotikumsuspension (ml) 1 0 1 0 1 0

Ansatzvolumen gesamt (ml) 10 10 10 10 10 10

LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin

Tabelle 13: Pipettierschema für die Versuchsreihe mit Moxifloxacin

Monokulturen

E. coli Mischkulturen

MOX+ MOX- MOX+ MOX-

Brucella-Bouillon (ml) 14 16 10 12

E. coli-Suspension (ml) 4 4 4 4

B. fragilis-Suspension (ml) 0 0 4 4

Antibiotikumsuspension (ml) 2 0 2 0

Ansatzvolumen gesamt (ml) 20 20 20 20

MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin

4.6.2 Versuchsdurchführung

In Abbildung 8 ist das Pipettierschema für den Versuchsablauf bei Mischkulturen mit

entsprechendem Verdünnungsfaktor vereinfacht dargestellt. Zunächst wurden jeweils 6,6 µl

Bakteriensuspension aus den Inokula der Mischkulturen auf ein supplementiertes Columiba-

Methoden

35

Gentamicin-Agarmedium und ein Endo-Agarmedium pipettiert. Weitere 6,6 µl wurden in ein

Eppendorfgefäß mit 660 µl 0,9%iger NaCl-Lösung pipettiert und vermischt, um eine

Verdünnung der Bakterienkonzentration von 1:100 erhalten.

Im zweiten Schritt wurden dreimal jeweils 6,6 µl aus der zuvor verdünnten

Bakteriensuspension des Eppendorfgefäßes entnommen und auf ein supplementiertes

Columbia-Gentamicin-Agarmedium, ein Endo-Agarmedium und in 660 µl 0,9%ige NaCl-

Lösung gebracht. Der Inhalt des Eppendorfgefäßes wurde wieder gleichmäßig vermischt und

man erhält eine weitere Verdünnungsstufe von 1:100. Im dritten Schritt wurden erneut jeweils

6,6 µl aus dem im zweiten Schritt bearbeiteten Eppendorfgefäß entnommen und wiederum

auf ein supplementiertes Columbia-Gentamicin-Agarmedium, ein Endo-Agarmedium und in

66 µl 0,9%ige NaCl-Lösung eines Eppendorfgefäßes pipettiert. Von der zuvor hergestellten,

1:10 verdünnten Bakteriensuspension wurden 6,6 µl entnommen und auf ein supplementiertes

Columbia-Gentamicin-Agarmedium und ein Endo-Agarmedium gebracht.

Abbildung 8: Pipettierschema und Verdünnungsfaktor pro 1 ml bei Mischkulturen A, Inokulumansatz; C, Columbia-Gentamicin-Agarmedium; E, Endo-Agarmedium

Durch die einzelnen Verdünnungsstufen sollte die Vermeidung des "Drug-carry-over"-

Phänomens und eine Optimierung bei der Ablesung der Versuchsergebnisse erzielt werden.

Das "Drug-carry-over" bezeichnet die Hemmung des bakteriellen Wachstums in vitro,

bedingt durch zu hohe Antibiotikumkonzentrationen im Inokulum. Bei der Entnahme der

Verdünnungsfaktor pro 1 ml

1:151

1:151 × 102

1:151 × 104

1:151 × 105

Methoden

36

Proben kann neben Bakterien und Bouillon auch Antibiotikum mit entnommen werden. Es

kann daher zu einer weiteren Hemmung des bakteriellen Wachstums kommen. Durch die

Verdünnungen geht man von einer vernachlässigbaren Wirkung des Antibiotikums aus [104,

158].

Die zuvor auf die Agarmedien aufgebrachten Bakteriensuspensionen wurden mittels

Drygalskispatel in drei Richtungen gleichmäßig ausgestrichen. Die Endo-Agarmedien wurden

für 24 h unter aeroben Bedingungen bei 37 °C bebrütet. Die supplementierten Columbia-

Gentamicin-Agarmedien wurden für 48 h bei 37 °C in anaerober Atmosphäre inkubiert.

Um die Elimination der Antibiotika zu simulieren, wurden die Volumina der

supplementierten Brucella-Bouillon nach Vorgaben der Tabellen 18 und 19 (Anhang 1 und 2)

in die Ansätze pipettiert. Danach wurden die Inokula sofort für weitere 30 Minuten bei 37 °C

anaerob inkubiert. Insgesamt wurden alle 30 Minuten in jedem einzelnen Pipettierschritt

19,98 µl Bakteriensupsension aus den Ansatzbehältnissen entnommen, dreimal verdünnt und

jeweils gleichmäßig ausgestrichen. Die zum Auszählen der Bakterienzahlen ausgestrichenen

Anteile der Inokula von insgesamt 19,98 µl wurden bei der Berechnung der zuzugebenen

Volumina vom Gesamtvolumen abgezogen.

In der Versuchsdurchführung für die Monokulturen der E. coli und B. fragilis Stämme

wurden im ersten Verdünnungsschritt jeweils 6,6 µl des Inokulums verworfen, um gleiche

Volumenabnahmen in Mono- und Mischkulturen zu erhalten.

4.6.3 Ablesung der Versuchsergebnisse und Berechnung der Abtötungsraten Nach Inkubation der Agarmedien erfolgte die Ablesung, wobei unter günstigen

Wachstumsbedingungen jedes Bakterium eine Kolonie bildete. Ein Problem stellte die

Bildung von Bakterienverbänden dar, da jeder aus mehreren Bakterien bestehende Verband

eventuell nur eine Kolonie bilden konnte. Dieser Bakterienverband wurde deshalb als eine

Kolonie gewertet. Das Ergebnis wird als Koloniebildende Einheiten pro 1 ml angegeben und

nachfolgend als KBE/ml bezeichnet. Die Nachweisgrenze lag bei 101 KBE/ml.

Die Kolonien wurden gezählt und mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert.

Um die tatsächliche Zahl der Koloniebildenden Einheiten zu erhalten, wurde folgende Formel

angewandt:

KBEt [KBE/ml] = (C0 / Ct) × KBEt(gezählt)

KBEt Anzahl der KBE zum Zeitpunkt t (KBE/ml)

C0 Bakteriendichte im Inokulum bei Versuchsbeginn (mg/l)

Methoden

37

Ct Bakteriendichte im Inokulum zum Zeitpunkt t (mg/l)

KBEt(gezählt) Anzahl der KBE im Inokulum zum Zeitpunkt t (KBE(gezählt)/ml)

Die Reduktion der KBE, welche in Log-Stufen angegeben wird, berechnet sich nach DIN

58940-7: 1994-09 nach folgender Gleichung [6]:

RKBE = Log10 (KBET0) – Log10 (KBETx)

Die prozentuale Reduktion der KBE lässt sich durch folgende Gleichung berechnen:

RKBE[%] = 100 – (KBETx/KBET0 × 100)

KBET0 KBE im Inokulum bei Versuchsbeginn in ml

KBETx KBE der Testsuspension nach Entnahme zum Zeitpunkt Tx in ml

(Tx beschreibt in diesem in vitro Modell den Endzeitpunkt des

Versuches (tLEV=13h, tMOX =12h)

Eine Reduktion der KBE um 3 Log-Stufen entspricht dabei einer Reduktion um 99,9%.

4.6.4 Berechnung der pharmakologischen Indizes

Als AUC wird die Fläche unterhalb der Konzentrations-Zeit-Kurve bezeichnet. Wenn nicht

explizit ausgeschrieben, bezieht sich die AUC auf einen Zeitraum von 24 h. Die AUC wird

mit folgender Formel als Integral über der Zeit errechnet:

∫∞

∞→ =0

0 )( dttCAUC [mg×h/l]

Bei einer linearen Kinetik lässt sich die AUC vereinfacht mit der Trapezregel berechnen,

welche nachfolgend aufgeführt ist [31]:

))(( 11

121

0 −=

−→ −+= ∑ xxx

n

ixt ttCCAUC

n

AUC Area under the curve [mg×h/l]

Methoden

38

Cx Konzentration zum Zeitpunkt tx [mg/l]

Cx-1 Konzentration zum Zeitpunkt tx-1 [mg/l]

tn letzter zu berechnender Zeitpunkt [h]

Dividiert man die AUC durch die MHK, erhält man den Index:

� MHKAUC [dimensionslos]

Das Verhältnis aus maximaler Plasmakonzentration und MHK wird durch den folgenden

Index beschrieben:

� MHKCmax [dimensionslos]

4.6.5 Statistische Datenanalyse Die errechneten KBE wurden in einer Tabelle erfasst und mit Hilfe von Graph Pad Prism5

Software (Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, USA) graphisch dargestellt.

Zur statistischen Analyse der Trends der Abtötungsraten über die Zeit wurde der Mann-

Trend-Test angewandt [70, 75]. Dabei wurde ein p-Wert < 0,05 als signifikant und ein p-Wert

< 0,01 als hochsignifikant gewertet. P-Werte über 0,05 wurden als nicht signifikant gewertet.

Die Versuche zur Aktivität von Moxifloxacin in Monokultur mit den B. fragilis Stämmen

wurden von Schaumann et al. durchgeführt und ausgewertet [146]. Die Werte der KBE der B.

fragilis Stämme dieser Versuche wurden für die statische Analyse der vorliegenden Arbeit

(Vergleich der Trends der Abtötungsraten in Mono- und Mischkulturen) freundlicherweise

durch Schaumann et al. zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse

39

5 Ergebnisse

5.1 Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf supplementiertem Columbia-

Gentamicin-Agar und Beschreibung der Bakterienstämme

Auf den supplementierten Columbia-Agarmedien wachsen sowohl B. fragilis und E. coli

Stämme. Um die Auszählung der Mischkulturen zu erleichtern, wurde supplementierter

Columbia-Gentamicin-Agar mit dem Inokulum beimpft, um somit eine eventuelle

Wachstumshemmung der E. coli Stämme zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14

aufgeführt. Da sich nach der Inkubation von 48 h bei den zu verschiedenen Zeitpunkten (0,

0,5, 1, 2, 4, 6, 8 h) ausgestrichen Inokula vergleichbare Ergebnisse ergaben, sind die Zeiten

nicht extra aufgeführt.

Tabelle 14: Ergebnisse des Versuches der Wachstumshemmung auf supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agarmedium

Stamm supplementierter

Columbia-Agar

supplementierter Columbia-

Gentamicin-Agar

E. coli ATCC 25922 Wachstum kein Wachstum

E. coli VA 4050 Wachstum Wachstum

E. coli BK 12944 Wachstum kein Wachstum

E. coli VA 6886 Wachstum kein Wachstum

Der E. coli Stamm VA 4050 ist resistent gegenüber Gentamicin. Auf den supplementierten

Columbia-Gentamicin-Agarmedien war ein uneingeschränktes Wachstum des

Bakterienstamms zu sehen. Daher wurden sowohl der E. coli Stamm VA 4050 als auch die B.

fragilis Stämme auf einem supplementierten Columbia-Gentamicin-Agarmedium ausgezählt.

Die E. coli Kolonien wurden mit denen auf Endo-Agar wachsenden E. coli Kolonien

verglichen und stimmten dabei in ihrer Zahl weitgehend überein. Alle B. fragilis Stämme

wuchsen auf supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agarmedium.

Die E. coli Stämme bilden nach 24 h unter aeroben Bedingungen deutlich sichtbare Kolonien

auf Endo-Agar, sind lactosepositiv und haben eine glatte Oberfläche. Die E. coli Kolonien der

Stämme VA 6886 und ATCC 25922 erscheinen hierbei rund mit einem Durchmesser von

ungefähr 5 mm. Die Kolonien der E. coli Stämme VA 4050 und BK 12944 sind ebenfalls

rund mit einem Durchmesser von ungefähr 1-3 mm. Die B. fragilis Kolonien haben auf den

supplementierten Columbia-Agarmedien und Columbia-Gentamicin-Agarmedien einen

Ergebnisse

40

Durchmesser von 1-3 mm und sind glattwandig mit leicht glänzender Oberfläche und einem

grauen Kolorit. Die Kolonien des E. coli Stammes VA 4050 haben auf supplementiertem

Columbia-Gentamicin-Agarmedium einen Durchmesser von 1-3 mm mit einem

hellschimmernden beigefarbenen Hof und einem gelbfarbenen zentralen Punkt. Dadurch ist

dieser Stamm deutlich von den B. fragilis Stämmen zu unterscheiden.

5.2 Ergebnisse der MHK-Bestimmung

Bei den untersuchten Stämmen wurden die in Tabelle 15 aufgeführten MHK-Werte ermittelt.

Da diese Untersuchungen für jeden Stamm mindestens dreimal durchgeführt wurden, ergeben

sich zum Teil voneinander abweichende Werte. Die Bewertung des Grenzwertes bezüglich

der Empfindlichkeit erfolgt nach DIN 58940-4 Beiblatt 1 (Mai 2010) [5] in sensibel (s),

intermediär (i) und resistent (r) und ist angepasst an definierte Grenzwerte der EUCAST [8].

Grenzwerte Levofloxacin: ≤ 1 (s), 2 (i), > 2 (r) [5]

Grenzwerte Moxifloxacin: ≤ 0,5 (s), 1 (i), > 1 (r) [5]

Tabelle 15: MHK-Werte (mg/l) und Grenzwerte nach DIN 58940-4 [5]

Stamm Levofloxacin Moxifloxacin

E. coli ATCC 25922 0,008-0,03 (s) 0,015-0,03 (s)

E. coli VA 4050 > 32 (r) > 32 (r)

E. coli BK 12944 > 32 (r) > 32 (r)

E. coli VA 6886 > 32 (r) > 32 (r)

B. fragilis RMA 6791 1-2 (s)-(i) 0,25-0,5 (s)

B. fragilis WAL R 13267 > 32 (r) > 32 (r)

B. fragilis RMA 5120 1 (s) 0,12-0,5 (s)

B. fragilis RMA 0309 0,25-1 (s) 0,12-0,25 (s)

Ergebnisse

41

5.3 Aktivität von Levofloxacin und Moxifloxacin im in vitro PK/PD-Modell

5.3.1 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter

aeroben und anaeroben Bedingungen

Im Ansatz mit Levofloxacin werden die KBE des E. coli Stammes ATCC 25922 unter

aeroben Versuchsbedingungen (Abb. 9) signifikant reduziert (p < 0,01). Levofloxacin wirkt

unter aeroben Bedingungen bakterizid (Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA

4050, BK 12944 und VA 6886 lassen sich unter aeroben Versuchsbedingungen keine

signifikanten Unterschiede in den Wachstumskurven mit und ohne Antibiotikum feststellen

(p > 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

2

4

6

8

10

EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 9: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin unter aeroben Bedingungen. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. Auch unter anaeroben Bedingungen (Abb. 10) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC

25922 durch Levofloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). Dabei wirkt Levofloxacin jedoch

nicht bakterizid (Abtötungsrate 99,1%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und

VA 6886 lassen sich auch unter anaeroben Versuchsbedingungen keine signifikanten

Unterschiede in den Wachstumskurven mit und ohne Levofloxacin feststellen (p > 0,05).

Ergebnisse

42

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 134

5

6

7

8

9

10

EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 10: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin unter anaeroben Bedingungen. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Levofloxacin unter aeroben Versuchsbedingungen

signifikant besser wirkt als unter anaeroben Versuchsbedingungen (p < 0,01).

5.3.2 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter

aeroben und anaeroben Bedingungen

Unter aeroben Versuchsbedingungen (Abb. 11) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC

25922 durch Moxifloxacin signifikant reduziert (p < 0,05). Moxifloxacin wirkt bakterizid

(Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und VA 6886 lassen

sich unter aeroben Bedingungen zwischen den Versuchen mit und ohne Antibiotikum im

Wachstumsverhalten keine signifikanten Unterschiede feststellen (p > 0,05).

Auch unter anaeroben Bedingungen (Abb. 12) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC

25922 durch Moxifloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). Moxifloxacin wirkt auch hier

bakterizid (Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und VA

6886 lassen sich auch unter anaeroben Bedingungen keine signifikanten Unterschiede in den

Wachstumskurven mit und ohne Moxifloxacin feststellen (p > 0,05).

Ergebnisse

43

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

1

2

4

6

8

10

EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-EC ATCC 25922 MOX+ EC ATCC 25922 MOX-EC VA 6886 MOX+ EC VA 6886 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 11: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Moxifloxacin unter aeroben Bedingungen. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

1

2

6

7

8

9

10

EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-EC ATCC 25922 MOX+ EC ATCC 25922 MOX-EC VA 6886 MOX+ EC VA 6886 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 12: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Moxifloxacin unter anaeroben Bedingungen. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich unter aeroben und anaeroben

Versuchsbedingungen für Moxifloxacin keine signifikanten Unterschiede in der Aktivität

ergeben (p > 0,05).

Ergebnisse

44

5.3.3 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen in Monokultur

Durch Levofloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und

RMA 0309 (Abb. 13) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin nicht

bakterizid (Abtötungsraten: RMA 6791 41,2%; RMA 5120 34,7%; RMA 0309 94,6 %). Bei

dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 lässt sich zwischen den Versuchen mit und ohne

Antibiotikum kein signifikanter Unterschied im Wachstumsverhalten feststellen (p > 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-BF RMA 5120 LEV+ BF RMA 5120 LEV-BF RMA 0309 LEV+ BF RMA 0309 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 13: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

5.3.4 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm ATCC 25922 in Mischkultur

In den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791 und WAL R 13267 (Abb. 14)

bestehen keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten des E. coli Stammes

ATCC 25922 mit und ohne Antibiotikum (p < 0,05). Im Gegensatz dazu wird der E. coli

Stamm in der Monokultur durch Levofloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). In den

Mischkulturen sind die Wachstumsraten der B. fragilis Stämme RMA 6791 und WAL R

13267 mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). In der Monokultur wirkt

Levofloxacin aber signifikant besser auf den B. fragilis Stamm RMA 6791 als in der

Mischkultur (p < 0,01). Dieser Unterschied besteht bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267

nicht (p > 0,05).

Ergebnisse

45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 132

4

6

8

10

EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 14: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) ATCC 25922 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml

In den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 15)

werden die KBE des E. coli Stammes ATCC 25922 im Ansatz mit Levofloxacin reduziert

(Abtötungsraten 99,7% und 99,3%). Im Vergleich mit den Kontrollkulturen ohne

Antibiotikum ist diese Reduktion jedoch nicht signifikant (p > 0,05). Im Gegensatz dazu

reduziert Levofloxacin die KBE dieses E. coli Stammes in den Monokulturen signikant (p <

0,01). Weiterhin reduziert Levofloxacin die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120

(Abtötungsrate 75,4%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 66,2%) in den Mischkulturen

signifikant (p < 0,01). Dabei wirkt aber Levofloxacin in der Monokultur signifikant besser auf

den B. fragilis Stamm RMA 0309 gegenüber der Mischkultur (p < 0,01). Dieser Unterschied

ist bei dem B. fragilis Stamm RMA 5120 nicht vorhanden (p > 0,05).

Ergebnisse

46

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

2

4

6

8

10

EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-BF RMA 5120 LEV+ BF RMA 5120 LEV-BF RMA 0309 LEV+ BF RMA 0309 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 15: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) ATCC 25922 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

5.3.5 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 4050 in Mischkultur

Für den E. coli Stamm VA 4050 ergibt sich in allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B.

fragilis Stämmen (RMA 6791, WAL R 13267, RMA 5120, RMA 0309) kein signifikanter

Unterschied der Wachstumsraten mit und ohne Antibiotikum (p > 0,05). Allerdings ist die

Wachstumsrate dieses E. coli Stammes in Monokultur gegenüber den Mischkulturen (Abb. 16

und 17) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).

Die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Mischkultur (Abb. 16) ist mit

Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin in der

Monokultur signifikant besser auf den B. fragilis Stammes RMA 6791 als in der Mischkultur

(p > 0,01). Im Gegensatz dazu bestehen bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 mit und

ohne Levofloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikanten Unterschiede

im Wachstumsverhalten (p > 0,05).

Ergebnisse

47

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 16: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

In den Ansätzen mit Levofloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120

(Abtötungsrate 49,5%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 94,2%) in den Mischkulturen (Abb.

17) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin in den Monokulturen

signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p < 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-BF RMA 5120 LEV+ BF RMA 5120 LEV-BF RMA 0309 LEV+ BF RMA 0309 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 17: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Ergebnisse

48

5.3.6 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm BK 12944 in Mischkultur

In allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,

RMA 5120 und RMA 0309 ergeben sich für den E. coli Stamm BK 12944 keine signifikanten

Unterschiede in den Wachstumsraten mit und ohne Levofloxacin (p > 0,05). Die

Wachstumsrate dieses E. coli Stammes ist aber in den Monokulturen gegenüber den

Mischkulturen (Abb. 18 und 19) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).

In der Mischkultur (Abb. 18) ist die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 mit

Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Aber Levofloxacin wirkt in der Monokultur des

B. fragilis Stammes RMA 6791 signifikant besser im Vergleich mit der Mischkultur (p <

0,01). Im Gegensatz dazu bestehen bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 mit und ohne

Levofloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikanten Unterschiede in

den Wachstumsraten (p > 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 18: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. In der Mischkultur (Abb. 19) werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 5120 mit

Levofloxacin moderat (Abtötungsrate 26,3%), aber im Vergleich mit der Kontrollkultur ohne

Antibiotikum nicht signifikant reduziert (p > 0,05). Im Gegensatz dazu reduziert

Levofloxacin die KBE des B. fragilis Stammes RMA 0309 in der Mischkultur signifikant

(Abtötungsrate 75,1%; p < 0,01). Levofloxacin wirkt allerdings in den Monokulturen beider

Ergebnisse

49

B. fragilis Stämme signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p

< 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-BF RMA 5120 LEV+ BF RMA 5120 LEV-BF RMA 0309 LEV+ BF RMA 0309 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 19: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

5.3.7 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 6886 in Mischkultur

Für den E. coli Stamm VA 6886 ergibt sich in allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B.

fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267, RMA 5120 und RMA 0309 kein signifikanter

Unterschied der Wachstumsraten mit und ohne Antibiotikum (p > 0,05). Allerdings ist die

Wachstumsrate des E. coli Stammes VA 6886 in Monokultur gegenüber den Mischkulturen

(Abb. 20 und 21) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).

Die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Mischkultur (Abb. 20) ist mit

Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Aber Levofloxacin wirkt in der Monokultur

signifikant besser auf den B. fragilis Stamm RMA 6791 als in der Mischkultur (p < 0,01). Für

den B. fragilis Stamm WAL R 13267 bestehen im Gegensatz dazu mit und ohne Levofloxacin

zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikante Unterschiede in den

Wachstumskurven (p > 0,05).

Ergebnisse

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 20: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 6886 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Mit Levofloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 5120 in der Mischkultur

(Abb. 21) moderat reduziert (Abtötungsrate 40,5%). Im Vergleich mit der Kontrollkultur

ohne Antibiotikum ist diese Reduktion aber nicht signifikant (p > 0,05). Im Gegensatz dazu

kommt es in der Mischkultur mit Levofloxacin bei dem B. fragilis Stamm RMA 0309 zu

einer geringen, aber dennoch signifikanten Reduktion der KBE (p < 0,01; Abtötungsrate

7,8%). Allerdings wirkt Levofloxacin in den Monokulturen dieser beiden B. fragilis Stämme

signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p < 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135

6

7

8

9

10

EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-BF RMA 5120 LEV+ BF RMA 5120 LEV-BF RMA 0309 LEV+ BF RMA 0309 LEV-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 21: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 6886 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Ergebnisse

51

5.3.8 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm VA 4050 in Mischkultur

Für den E. coli Stamm VA 4050 lassen sich zwischen den Versuchen mit und ohne

Antibiotikum in den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,

RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 22 und 23) keine signifikanten Unterschiede im

Wachstumsverhalten feststellen (p > 0,05). Es bestehen ebenfalls keine signifikanten

Unterschiede im Vergleich der KBE dieses Stammes in Mono- und Mischkulturen im Ansatz

mit Moxifloxacin (p > 0,05).

Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der

Mischkultur (Abb. 22) signifikant reduziert (p < 0,01; Abtötungsrate 63,1%). Allerdings

reduziert Moxifloxacin die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Monokultur

signifikant besser als in der Mischkultur (p < 0,01). Bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267

bestehen mit und ohne Moxifloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine

signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten (p > 0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125

6

7

8

9

10

EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-BF RMA 6791 MOX+ BF RMA 6791 MOX-BF WAL R 13267 MOX+ BF WAL R 13267 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 22: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120

(Abtötungsrate 61,2%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 60,8%) in den Mischkulturen (Abb.

23) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Moxifloxacin auch hier in den

Monokulturen signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p

< 0,01).

Ergebnisse

52

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125

6

7

8

9

10

EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-BF RMA 5120 MOX+ BF RMA 5120 MOX-BF RMA 0309 MOX+ BF RMA 0309 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 23: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

5.3.9 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli

Stamm BK 12944 in Mischkultur

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125

6

7

8

9

10

EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-BF RMA 6791 MOX+ BF RMA 6791 MOX-BF WAL R 13267 MOX+ BF WAL R 13267 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 24: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Für den E. coli Stamm BK 12944 ergeben sich zwischen den Versuchen mit und ohne

Antibiotikum in den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,

Ergebnisse

53

RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 24 und 25) keine signifikanten Unterschiede in den

Wachstumskurven (p > 0,05). Gleichfalls gibt es keine signifikanten Unterschiede der KBE

dieses E. coli Stammes zwischen Mono- und Mischkulturen in Anwesenheit von

Moxifloxacin (p > 0,05).

Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der

Mischkultur (Abb. 24) signifikant reduziert (p < 0,01; Abtötungsrate 31,8%). Dabei wirkt

Moxifloxacin in der Monokultur dieses B. fragilis Stammes im Vergleich mit der Mischkultur

signifikant besser (p < 0,01). Bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 bestehen bei den

Versuchen mit und ohne Moxifloxacin zwischen Misch- und Monokulturen keine

signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten (p > 0,05).

Im Ansatz mit Moxifloxacin kommt es in der Mischkultur bei dem B. fragilis Stamm RMA

5120 (Abb. 25) zu einer geringen, aber dennoch signifikanten Reduktion der KBE (p < 0,01;

Abtötungsrate 18,2%). Außerdem werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 0309 in der

Mischkultur mit Antibiotikum signifikant reduziert (p < 0,01; Abtötungsrate 96,5%). Aber

auch hier wirkt Moxifloxacin in den Monokulturen beider B. fragilis Stämme signifikant

besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p < 0,01).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125

6

7

8

9

10

EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-BF RMA 5120 MOX+ BF RMA 5120 MOX-BF RMA 0309 MOX+ BF RMA 0309 MOX-

Zeit [h]

Log

10K

BE

/ml

Abbildung 25: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.

Ergebnisse

54

5.3.10 Zusammenfassung der PK/PD-Untersuchung

Mit Levofloxacin kommt es unter aeroben und anaeroben Bedingungen in den Monokulturen

zu einer signifikanten Reduktion der KBE des E. coli Stammes ATCC 25922 (p < 0,01).

Allerdings wirkt Levofloxacin nur unter aeroben Versuchsbedingungen bakterizid auf diesen

Stamm. In den Monokulturen der E. coli Stämme VA 4050, BK 12944 und VA 6886 lassen

sich unter aeroben und anaeroben Versuchsbedingungen in den Ansätzen mit Levofloxacin

keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten feststellen (p > 0,05). Des Weiteren

kommt es in den Monokulturen mit Levofloxacin zu signifikanten Reduktionen der KBE der

B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und RMA 0309 (p < 0,01). In den Mischkulturen

bestehen bei den Versuchen mit und ohne Levofloxacin in Bezug auf die KBE des E. coli

Stammes ATCC 25922 keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Hingegen wirkt

Levofloxacin in den Monokulturen der E. coli Stämme ATCC 25922, VA 4050, BK 12944

und VA 6886 signifikant besser als in den Mischkulturen (p < 0,01). In den Mischkulturen

werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120 und RMA 0309 reduziert. Levofloxacin

wirkt aber in den Monokulturen der B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und RMA

0309 signifikant besser als in den Mischkulturen (p < 0,05). Bei dem B. fragilis Stamm WAL

R 13267 bestehen bei den Versuchen mit und ohne Levofloxacin zwischen Misch- und

Monokulturen keine signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten (p > 0,05).

Im Gegensatz zu Levofloxacin wirkt Moxifloxacin in den Monokulturen sowohl in aerober

als auch anaerober Umgebung bakterizid auf den E. coli Stamm ATCC 25922. Bei den E. coli

Stämmen VA 4050, BK 12944 und VA 6886 bestehen zwischen den Versuchen mit und ohne

Moxifloxacin sowohl in Mono- und Mischkulturen keine signifikanten Unterschiede in den

Wachstumskurven (p > 0,05). Es besteht ebenfalls kein signifikanter Unterschied (p > 0,05)

in den Wachstumsraten der Monokulturen der E. coli Stämme VA 4050, BK 12944 und VA

6886 unter aeroben und anaeroben Bedingungen (mit und ohne Antibiotikum). Mit

Moxifloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und RMA

0309 in den Mischkulturen signifikant reduziert (p < 0,01). Moxifloxacin wirkt auf die

Reduktion der KBE in den Monokulturen der B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und

RMA 0309 im Vergleich mit den Mischkulturen signifikant besser (p < 0,01).

5.3.11 Pharmakologische Indizes

Mittels Trapezregel ergibt sich bei der vorliegenden Arbeit für Levofloxacin ein Wert der

AUC von 99,8 mg/l unter Zugrundelegung einer maximalen Plasmakonzentration von 6 mg/l

Ergebnisse

55

bei zweimal täglicher Applikation. Für Moxifloxacin ergibt sich ein AUC-Wert von 55,7 mg/l

unter Annahme einer maximalen Plasmakonzentration von 4 mg/l bei einmal täglicher

Verabreichung. In den Tabellen 16 und 17 sind die berechneten Indizes von Moxifloxacin

und Levofloxacin angegeben.

Bei den gegenüber Levofloxacin resistenten E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944, VA 6886

und dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 ergeben sich niedrige Quotienten der AUC/MHK

von 3 und der Cmax/MHK von 0,19 für Levofloxacin, wie in Tabelle 16 aufgelistet. Im

Gegensatz dazu ergeben sich für den E. coli Stamm ATCC 25922 hohe Werte der AUC/MHK

zwischen 3326 und 12473. Für die B. fragilis Stämme RMA 5120 und 0309 liegen die

berechneten AUC/MHK-Werte zwischen 100 und 399. Bei dem B. fragilis Stamm RMA 6791

liegen die Werte der AUC/MHK zwischen 50 und 100.

Tabelle 16: Berechnete pharmakologische Indizes von Levofloxacin

Bakterienstamm MHKLEV (mg/l) AUC/MHK Cmax/MHK

E. coli ATCC 25922 0,008-0,03 3326-12473 200-750

E. coli VA 4050 > 32 3 0,19

E. coli BK 12944 > 32 3 0,19

E. coli VA 6886 > 32 3 0,19

B. fragilis RMA 6791 1-2 50-100 3-6

B. fragilis WAL R 13267 > 32 3 0,19

B. fragilis RMA 5120 1 100 6

B. fragilis RMA 0309 0,25-1 100-399 6-24

Bei den gegenüber Moxifloxacin resistenten E. coli Stämmen VA 4050, BK 12044, VA 6886

und dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 ergeben sich ebenfalls niedrige Quotienten der

AUC/MHK von 2 und der Cmax/MHK von 0,13 (Tabelle 17). Für den E. coli Stamm ATCC

25922 lassen sich im Gegensatz dazu sehr hohe Quotienten der AUC/MHK zwischen 1857

und 3715 für Moxifloxacin berechnen. Bei den ebenfalls gegenüber Moxifloxacin sensiblen

B. fragilis Stämmen RMA 6791, RMA 5120 und RMA 0309 liegen die berechneten

AUC/MHK-Werte zwischen 111 und 464.

Ergebnisse

56

Tabelle 17: Berechnete pharmakologische Indizes von Moxifloxacin

Bakterienstamm MHKMOX (mg/l) AUC/MHK Cmax/MHK

E. coli ATCC 25922 0,015-0,03 1857-3715 133-267

E. coli VA 4050 > 32 2 0,13

E. coli BK 12944 > 32 2 0,13

E. coli VA 6886 > 32 2 0,13

B. fragilis RMA 6791 0,25-0,5 111-223 8-16

B. fragilis WAL R 13267 > 32 2 0,13

B. fragilis RMA 5120 0,12-0,5 111-464 8-33

B. fragilis RMA 0309 0,12-0,25 223-464 16-33

Diskussion und Ausblick

57

6 Diskussion und Ausblick

Intraabdominelle Infektionen stellen ein bedeutendes klinisches Problem dar und zählen

neben Pneumonie und Sepsis zu den wichtigsten Ursachen der infektionsbedingten

Morbidität und Letalität [26]. Da die Letalität der intraabdominellen Infektionen,

insbesondere der postoperativen Peritonitis bis zu 60% betragen kann [26], ist eine adäquate

Behandlung, bestehend aus chirurgischer Intervention und begleitender antibiotischer

Therapie, notwendig [30, 33]. Dabei ist für den Therapieerfolg von Infektionen die Kenntnis

über die Wirksamkeit und Empfindlichkeit der Erreger gegenüber dem Antibiotikum

bedeutend [50]. Im klinischen Alltag sind die Indikations- und Sicherstellung von optimalen

Therapiedosen basierend auf pharmakodynamischen Prinzipien entscheidend, um optimale

Therapieerfolge zu erzielen und das Auftreten von Resistenzen und Therapieversagen zu

mindern [133].

Durch die Bestimmung der MHK lässt sich abschätzen, ob ein Antibiotikum eine

therapeutische Option bietet [136]. Nguyen et al. konnten beispielsweise in einer

prospektiven Studie zeigen, dass zwischen in vitro Empfindlichkeit (MHK-Bestimmung) und

klinischem Outcome bei Patienten mit Bacteroides-verursachter Bakteriämie eine enge

Korrelation bestand [121]. Daraus lässt sich zunächst für die in der vorliegenden Arbeit

ermittelten MHK-Werte ableiten, dass Levofloxacin und Moxifloxacin eine Therapieoption

bei Infektionen mit B. fragilis und E. coli Stämmen darstellen können.

Mit dem vorliegenden PK/PD-Modell konnte zunächst gezeigt werden, dass es durch

Levofloxacin unter anaeroben im Gegensatz zu aeroben Bedingungen zu keiner vollständigen

Abtötung des sensiblen E. coli Stammes in der Monokultur kommt. Moxifloxacin wirkte in

beiden Versuchsdurchführungen bakterizid auf diesen Stamm. In anderen Untersuchungen

konnten im Vergleich von aerober und anaerober Atmosphäre zwar keine Unterschiede in der

maximal antibakteriellen Wirkung von verschiedenen Fluorchinolonen gegenüber fakultativ

anaeroben Bakterien nachgewiesen werden, aber die bakterizide Aktivität trat unter

anaeroben Bedingungen deutlich später auf [187, 189].

Des Weiteren ließ sich in der vorliegenden Untersuchung in den Monokulturen feststellen,

dass Levofloxacin die Erregerzahl der sensiblen B. fragilis Stämme signifikant reduzierte,

aber nicht bakterizid wirkte. Schaumann et al. konnten ebenfalls keine bakterizide Wirkung

für Moxifloxacin gegenüber diesen B. fragilis Stämmen im in vitro Modell nachweisen [146].

In anderen in vitro Untersuchungen wurden hingegen für Levofloxacin und Moxifloxacin

bakterizide Wirkungen gegenüber obligat anaeroben Bakterien nachgewiesen [122, 130, 157].

Es handelte sich aber um andere als in dieser Arbeit verwendete Stämme. In

Diskussion und Ausblick

58

Übereinstimmung mit der vorliegenden Arbeit konnten Noel et al. in einem in vitro Modell

nachweisen, dass Moxifloxacin auf obligate Anaerobier einen niedrigeren antibakteriellen

Effekt (angegeben als Log-Reduktion) hatte als auf einen E. coli Stamm [122]. In der

vorliegenden Arbeit sind die Abtötungsraten der sensiblen B. fragilis Stämme mit

Levofloxacin geringer im Vergleich mit dem sensiblen E. coli Stamm. Auch die

Abtötungsraten der B. fragilis Stämme in Monokultur mit Moxifloxacin [146] sind im

Vergleich mit dem sensiblen E. coli Stamm geringer.

Weiterhin ließ sich nachweisen, dass die in vitro Aktivitäten von Levofloxacin und

Moxifloxacin in den Mischkulturen im Vergleich mit den Monokulturen deutlich reduziert

waren. Insbesondere die Abtötungsraten der sensiblen B. fragilis Stämme waren im Vergleich

mit den Monokulturen für beide Substanzen deutlich gemindert. Levofloxacin wirkte in den

Mischkulturen auf die Reduktion der KBE des sensiblen E. coli Stammes nicht signifikant.

Durch die vorliegende Arbeit lässt sich zunächst festhalten, dass sich durch die alleinige

MHK-Bestimmung keine Rückschlüsse über die antibakteriellen Aktivitäten von

Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber den untersuchten Bakterienstämmen in

Mischkulturen und unter geänderten atmosphärischen Bedingungen ziehen lassen. In vitro

ließen sich reduzierte Aktivitäten der beiden Substanzen nachweisen, wobei Moxifloxacin

trotz moderater Wirkung [146] antibakteriell aktiver als Levofloxacin war. Im Gegensatz zu

den niedrigen MHK-Werten ließen sich für die B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120

und RMA 0309 im vorliegenden in vitro PK/PD-Modell weder für Levofloxacin noch für

Moxifloxacin Abtötungsraten von mehr als 99,9% feststellen. Als Konsequenz könnte dieses

bedeuten, dass es trotz niedriger MHK-Werte der einzelnen Erreger zu einem

Therapieversagen kommt, da das Erregerspektrum polymikrobiell ist [94].

Die MHK-Bestimmung erfolgt nach einer standardisierten Referenzmethode [5]. Es wird die

Empfindlichkeit eines Bakterienstamms mit standardisiertem Inokulum gegenüber einer

antibakteriellen Substanz in vitro getestet und es ergibt sich ein numerischer Wert. Dieser

wird anhand von Grenzwerten klinisch in "sensibel", "intermediär" und "resistent" eingeteilt.

Anhand dieser Bewertungen wählt der klinisch tätige Arzt ein zur Therapie geeignetes

Antibiotikum aus.

Die Grenzwerteinteilung berücksichtigt nicht nur den MHK-Wert, sondern viele weitere

Faktoren wie Dosierung, Indikation, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Ergebnisse aus

Studien müssen mit einbezogen werden [27, 136].

Da bei den meisten Veröffentlichungen zu Empfindlichkeitsprüfungen MHK-Verteilungen

(MHK50 oder MHK90) angegeben werden, ist ein direkter Vergleich mit denen in der

Diskussion und Ausblick

59

vorliegenden Arbeit ermittelten MHK-Werten kritisch zu betrachten [184]. Werte der

MHK90 könnten durch resistenztragende Stämme stark ansteigen und dadurch die Verteilung

der MHK-Werte einer natürlichen Population falsch hoch darstellen [144]. MHK-

Verteilungen schließen hingegen Wildtypen ohne Resistenzmechanismen und solche Stämme

mit Resistenzmechanismen ein und sollten daher eher mit in die Bewertung der MHK

eingehen [136].

Die MHK-Bestimmung erfolgt unter Verwendung von Monokulturen. Im Gegensatz dazu

findet sich bei intraabdominellen Infektionen häufig ein polymikrobielles Erregerspektrum

und die Umgebungsbedingungen sind durch den Verbrauch von Sauerstoff zugunsten der

obligat anaeroben Bakterien verändert [148]. Zudem kommt es bei Infektionen zu

Veränderungen von pH-Wert, Sauerstoffpartialdruck (pO2) und Kohlendioxidpartialdruck

(pCO2) [94, 151]. Diese Faktoren können die antibakterielle Aktivität beeinflussen. Eine

Senkung des pH-Wertes kann eine verminderte Zellwandpermeabilität für das Antibiotikum

hervorrufen und dadurch zu einer verminderten Aktivität führen [54, 99]. Dalhoff et al.

konnten nachweisen, dass die in vitro Aktivität von Levofloxacin und Moxifloxacin bei einer

Senkung des pH-Wertes abnahm [42]. Falagas et al. wiesen nach, dass die in vitro

Empfindlichkeit von Stämmen der B. fragilis Gruppe bei Ansäuerung des Kulturmediums

auch gegenüber den Fluorchinolonen abnahm [54]. Emrich et al. konnten in einer aktuellen

Untersuchung nachweisen, dass die antibakterielle Wirkung von Levofloxacin und

Moxifloxacin bei einem pH-Wert von 5,8 gegenüber E. coli Stämmen im Vergleich zum pH-

Wert von 7,2 deutlich niedriger war [53]. Ein erniedrigter pH-Wert könnte daher ein

möglicher Einflussfaktor für die reduzierten Aktivitäten von Levofloxacin und Moxifloxacin

in der vorliegenden Arbeit sein. Daher müssen auch Infektionsart und -ort bei Bewertung der

MHK Berücksichtigung finden [115]. Aber auch die Inokulumgröße kann die antibakterielle

Aktivität insbesondere in den Mischkulturen beeinflussen [113, 152]. In den Mischkulturen

des vorliegenden PK/PD-Modells ist die Anzahl der KBE gegenüber den Monokulturen

deutlich erhöht. Stearne et al. kamen nach einer in vitro Untersuchung zu dem Schluss, dass

ein erhöhtes Inokulum ein signifikanter Faktor für die geminderte Aktivität von

Trovafloxacin gegenüber B. fragilis in Mischkulturen mit E. coli Stämmen ist [163]. Die

genannten Faktoren können in in vitro PK/PD-Modellen berücksichtigt und untersucht

werden und könnten dann mit in die Bewertung der MHK als Therapieempfehlung einfließen.

Bisher wurden aber alle Erreger nach einheitlichen Grenzwerten beurteilt. Dabei kam es

häufig zur Trennung von zusammenhängenden Erregerhäufungen, obwohl es sich um

Wildtyp-Verteilungen ohne Resistenzmechanismen handelt [136]. Durch die EUCAST

Diskussion und Ausblick

60

wurden für E. coli die Grenzwerte für Levofloxacin und Moxifloxacin Spezies-spezifisch

festgelegt. Für B. fragilis gibt es für Levofloxacin und Moxifloxacin bisher noch keine

Spezies-spezifischen Grenzwertfestlegungen durch die EUCAST [8]. Nicht Spezies-

spezifische Grenzwerte basieren auf festgelegten pharmakokinetisch/pharmakodynamischen

Daten und sind unabhängig von der MHK-Verteilung [8]. Wie in der vorliegenden Arbeit

gezeigt werden konnte, sind bei fehlenden Bakteriengruppen-spezifischen Grenzwerten

therapeutische Vorhersagen von Erfolg oder Misserfolg in Bezug auf die Interpretation der

Empfindlichkeitstestung nur eingeschränkt möglich [52]. Trotz niedriger MHK-Werte kam es

weder bei Levofloxacin noch bei Moxifloxacin [146] zu einer vollständigen Eradikation der

B. fragilis Stämme im in vitro PK/PD-Modell. Wenn die MHK-Bewertungen Spezies-

spezifisch und infektions- bzw. indikationsspezifisch sind, ergeben sich möglicherweise

höhere Grenzwerte. Um empirische Daten für die Therapieempfehlung zu erstellen, sollten

die Grenzwerteinteilungen daher Spezies-spezifisch und infektionsbezogen erfolgen [86, 115,

136, 155]. Dieses ist neben der Harmonisierung der MHK-Grenzwerte und der Bestimmung

einer gemeinsamen Referenzmethode zur MHK-Bestimmung Ziel der EUCAST [8, 27].

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die alleinige MHK-Bestimmung bei

Monokulturen mit Bewertung zur Therapieempfehlung bei Mischinfektionen nicht

ausreichend ist. Insbesondere bei polymikrobiellen Infektionen müssen weitergehende

Untersuchungen erfolgen, um Aussagen zur antibakteriellen Aktivität bei Mischinfektionen

zu treffen, die dann mit in die Bewertung der MHK einfließen, um letztlich erfolgreich zu

therapieren.

Im Weiteren wurden in der vorliegenden Arbeit die PK/PD-Indizes AUC/MHK und

Cmax/MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin für die untersuchten Stämme berechnet. Es

gibt zahlreiche Arbeiten und Untersuchungen, die sich mit der Entwicklung von PK/PD-

Indizes und deren Vorhersagemöglichkeiten beschäftigen [15, 16, 38, 48, 57, 58, 80]. Tabelle

20 im Anhang 3 enthält eine Auswahl an PK/PD-Indizes, vorzugsweise für Fluorchinolone,

mit den jeweils bestimmten Grenzwerten für Bakterizidie, Verbesserung des klinischen

Outcomes, Verhinderung des Auftretens von Wiederwachstum oder dem Auftreten von

Resistenzmechanismen. Schentag et al. geben für die Fluorchinolone folgende Werte an:

AUC/MHK-Quotienten > 125 führen zur Bakterizidie; AUC/MHK-Raten > 250 führen zu

einer schnellen bakteriziden Wirkung und Quotienten zwischen 30 und 60 führen zu

bakteriostatischen Effekten [150]. Wispelwey et al. fordern bei der Therapie von

gramnegativen Bakterien unabhängig von der Substanzklasse AUC/MHK-Raten > 100 für

Diskussion und Ausblick

61

einen antimikrobiellen Erfolg [185]. Thomas et al. konnten für AUC/MHK-Werte < 100 die

Förderung der Resistenzentwicklung und des Wiederwachstum nachweisen [175].

PK/PD-Indizes erlauben quantitative Vorhersagen bezüglich des Erfolgs oder des Versagens

einer antibiotischen Therapie [66]. Je kleiner der MHK-Wert ist, desto größer ist der

AUC/MHK-Quotient. Aber auch Änderungen der Pharmakokinetik führen zu Änderungen der

Quotienten. Dieses ist beispielsweise bei Vorliegen einer Niereninsuffizienz mit

eingeschränkter Clearance für ein Antibiotikum zu beachten.

In den Monokulturen des sensiblen E. coli Stammes kommt es unter aeroben Bedingungen zu

vollständigen Eradikationen, welche anhand der berechneten hohen Indizes von Levofloxacin

und Moxifloxacin auch so erwartet werden. Schon unter geänderten Umgebungsbedingungen

kommt es trotz des hohen AUC/MHK-Wertes von Levofloxacin gegenüber dem sensiblen E.

coli Stamm nicht zur Bakterizidie. Gegenüber den sensiblen B. fragilis Stämmen ist trotz

hoher Indizes keine vollständige Eradikation der Erreger festzustellen. Auch bei den

Mischkulturen geht man anhand der hohen AUC/MHK-Quotienten für die sensiblen

Bakterienstämme von guter antibakterieller Aktivität der beiden Substanzen aus, welche

anhand der ermittelten Daten so nicht vorliegen. Der von Schentag et al. angegebene

Grenzwert für eine schnelle bakterizide Wirkung (AUC/MHK > 250) ist daher in der

vorliegenden Arbeit nur für den sensiblen E. coli Stamm und unter Beachtung der

Umgebungsbedingungen zutreffend. Ein Vergleich mit der Übersichtsarbeit von Schentag et

al. ist aber auch wieder nur eingeschränkt möglich, da Erregerart und Versuchsdurchführung

unberücksichtigt bleiben [149, 150].

Welcher AUC/MHK-Wert letztlich entscheidend für den Erfolg oder das Versagen einer

Therapie ist, bedarf insbesondere für Mischkulturen und geänderten Bedingungen weiterer

Untersuchungen. Hierbei müssen unter anderem Faktoren, welche zu einer Reduktion der

antibakteriellen Aktivität führen, mit einbezogen werden. Auch durch Bestimmung von

Spezies-spezifischen Grenzwerten werden sich Änderungen der PK/PD-Indizes ergeben.

Es zeigt sich durch die vorliegende Arbeit, dass die Bestimmung der PK/PD-Indizes nicht nur

für Monokulturen, sondern auch für Mischkulturen sinnvoll ist. Möglicherweise kommt es zu

einem Therapieversagen eines Antibiotikums bei Mischinfektionen, obwohl hohe PK/PD-

Indizes und eine gute Wirksamkeit gegenüber den einzelnen Erregern vorliegen.

Diskussion und Ausblick

62

Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Moxifloxacin im Vergleich zu

Levofloxacin eine bessere in vitro Wirkung im PK/PD-Modell gegenüber Mono- und

Mischkulturen der ausgewählten B. fragilis und E. coli Stämme hat. Allerdings ist die

Aktivität von Moxifloxacin in den Mischkulturen auch nur moderat [146]. Durch

verschiedene Untersuchungen im Tiermodell und in vivo Studien konnten für Moxifloxacin

gute antibakterielle Aktivitäten bei Mischinfektionen durch fakultativ und obligate

Anaerobier gezeigt werden [51, 81, 108, 145, 162]. Die in der vorliegenden Arbeit

verwendeten Erreger stammen vornehmlich von schwerkranken Patienten und weisen deshalb

möglicherweise höhere MHK-Werte im Vergleich mit Erregern anderer Untersuchungen auf.

Auch der fehlende Einfluss des Immunsystems kann eine Erklärung für die reduzierten

antibakteriellen Aktivitäten von Levofloxacin und Moxifloxacin im in vitro PK/PD-Modell

sein [144].

Moxifloxacin ist nach aktuellen Empfehlungen zur Therapie intraabdomineller Infektionen

geeignet [27]. Für Levofloxacin wird eine Kombinationstherapie mit Metronidazol

empfohlen. In einer in vitro Studie zu Mischinfektionen mit B. fragilis und E. coli Stämmen

wirkte die Kombinationstherapie aus Levofloxacin und Metronidazol ebenso gut, wie eine

Monotherapie mit Moxifloxacin [73]. Dennoch sollte nach den Ergebnissen der vorliegenden

Arbeit eine antibiotische Therapie mit Levofloxacin oder Moxifloxacin kritisch hinterfragt

werden. Die zunehmenden Resistenzraten von E. coli oder Bacteroides spp. gegenüber den

Fluorchinolonen stellen zusätzlich ein großes Problem bei der Therapie intraabomineller

Infektionen dar [37, 61, 72, 154, 164].

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse ergeben sich weiterführende Untersuchungen, ob und

welche Änderungen sich für PK/PD-Indizes für ein polymikrobielles Erregerspektrum und

Veränderungen der Umgebungsbedingungen ergeben.

Zusammenfassung

63

7 Zusammenfassung der Arbeit

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.

Titel:

Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in

vitro Aktivität von Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber B.

fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur

eingereicht von:

Stefanie Rossi, geb. Hoffmann

angefertigt am:

Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie

der Universität Leipzig

betreut von:

PD Dr. med. Reiner Schaumann

Monat und Jahr

der Einreichung:

08/2012

Intraabdominelle Infektionen weisen meist ein polymikrobielles Erregerspektrum aus

fakultativ und obligat anaeroben Bakterien auf. E. coli und B. fragilis werden als häufigste

Erreger bei Mischinfektionen nachgewiesen. Häufigste Form der intraabdominellen

Infektionen stellt die sekundäre Peritonitis dar, wobei die postoperative Peritonitis die höchste

Letalitätsrate aufweist. Die Therapie von intraabdominellen Infektionen erfolgt primär

chirurgisch mit begleitender antibiotischer Therapie.

Durch in vitro PK/PD-Modelle können Aussagen über das Abtötungs- oder

Wachstumsverhalten von Bakterien in Abhängigkeit von Veränderungen der

Antibiotikumkonzentration getroffen werden und dadurch Vorgänge in vivo simuliert werden.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der pharmakodynamischen Aktivitäten von

Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber ausgewählten B. fragilis und E. coli Stämmen in

Mono- und Mischkulturen unter Berücksichtigung pharmakokinetischer Eigenschaften. Für

die E. coli Stämme erfolgten die Monokulturenversuche unter aeroben und anaeroben

Bedingungen.

Zusammenfassung

64

Vor Versuchsbeginn erfolgte die Empfindlichkeitstestung mittels Etest. Drei der getesteten

vier B. fragilis Stämme waren sensibel gegenüber Levofloxacin und Moxifloxacin. Ein E. coli

Stamm war sensibel gegenüber Levofloxacin und Moxifloxacin, die drei anderen Stämme

waren in der Empfindlichkeitstestung resistent gegenüber beiden Substanzen.

In der vorliegenden Arbeit wirkte Levofloxacin unter aeroben Bedingungen signifikant besser

auf einen sensiblen E. coli Stamm als unter anaeroben. Für Moxifloxacin ließen sich unter

aeroben und anaeroben Bedingungen gegenüber den E. coli Stämmen keine Unterschiede in

der antibakteriellen Wirkung nachweisen. Moxifloxacin wirkte auf den sensiblen E. coli

Stamm unter aeroben und anaeroben Bedingungen bakterizid. Außerdem reduzierte

Levofloxacin signifikant die KBE der sensiblen B. fragilis Stämme in den Monokulturen,

eine Bakterizidie ließ sich nicht feststellen. In den Mischkulturen zeigten sich für

Levofloxacin und Moxifloxacin reduzierte Aktivitäten gegenüber den Monokulturen.

Moxifloxacin zeigte in dieser Untersuchung eine bessere in vitro Aktivität in Mono- und

Mischkulturen von B. fragilis und E. coli Stämmen im Vergleich mit Levofloxacin.

Es konnte in vitro gezeigt werden, dass die antibakteriellen Aktivitäten von Levofloxacin und

Moxifloxacin in den Mischkulturen und für Levofloxacin unter geänderten

Umgebungsbedingungen gemindert sind. Diese Aussage ist durch alleinige MHK-

Bestimmung mit den Monokulturen nicht möglich. Es gelten andere Bedingungen bei

Mischkulturen. Weiterführende in vitro Untersuchungen zur antibiotischen Aktivität bei

Mischinfektionen sollten daher erfolgen. Infektionsart und -ort, sowie erregerspezifische

MHK-Werte müssen ebenso wie die Daten aus in vitro PK/PD-Modellen und Ergebnissen aus

klinischen Untersuchungen in die Bewertung der MHK als Therapieempfehlungen einfließen.

Die vorliegenden Daten unterstützen die Verwendung von PK/PD-Indizes für Versuche mit

Monokulturen, da sie bei Monoinfektionen eine gute Möglichkeit zur Vorhersage des

therapeutischen Effekts bieten. Im Unterschied dazu zeigen die Versuche mit den

Mischkulturen, dass PK/PD-Indizes nicht so ohne weiteres Aussagen über einen möglichen

Therapieerfolg bei einem polymikrobiellen Erregerspektrum zulassen.

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Erklärung

76

9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe

oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass

Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten

haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass

die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen

Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen

übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug

genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen

genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

……………………………….. ………………………………………..

Datum Unterschrift

Danksagung

77

10 Danksagung Ich möchte mich bei allen Menschen bedanken, die es mir ermöglicht haben, eine

Doktorarbeit anzufertigen und vor allem fertigzustellen.

In erster Linie möchte ich mich bei meiner großen Familie bedanken.

Lieber David, Danke, dass Du während der gesamten, wenn auch nicht immer leichten Zeit,

für mich da warst.

Liebe Mama, lieber Papa, liebe Oma, lieber Opa († 02.06.2012), Danke für Wochen, die Ihr

Emma zu Euch genommen habt, damit ich meine Arbeit schreiben konnte.

Ganz besonderer Dank gilt meiner Schwester Dana, die mich immer wieder aufgebaut hat

und mir viele hilfreiche Ratschläge gegeben hat.

Insbesondere gilt mein Dank PD Dr. med. Reiner Schaumann für die Bereitstellung des

Themas, die Unterstützung, Motivation und kritische Auseinandersetzung mit meiner Arbeit.

Ich bedanke mich bei Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff für die Möglichkeit der Durchführung

meiner Doktorarbeit an seinem Institut.

Des Weiteren möchte ich bei den Mitarbeitern des Instituts für Medizische Mikrobiologie und

Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig für Ihre Unterstützung und Hilfe bedanken.

Lebenslauf

78

11 Lebenslauf Persönliche Daten Stefanie Rossi geb. Hoffmann

Geboren am 18.03.1980

Lebenslauf

79

Veröffentlichung

80

12 Veröffentlichungen der Arbeit 1. Schaumann R., Hoffmann S., Hartmann J., Ackermann G., Rodloff A.C. Activity of

levofloxacin, piperacillin/tazobactam and imipenem aganist Bacteroides fragilis and

Escherichia coli in an in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model

employing pure and mixed cultures. ICAAC, Washington DC, 2004; Abstract A1164

2. Schaumann R., Rossi S., Rodloff A.C. Activity of levofloxacin and moxifloxacin

against B. fragilis and E. coli in an in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic

(PK/PD) model employing pure and mixed cultures. In Arbeit.

Anhang 1

81

Tabelle 18: Konzentrationsabfall von Levofloxacin bei einer Versuchsdauer von 13 h

Zeit (h) Konzentration

(mg/l)

Volumen

vor Abzug

(ml)

Volumen

nach

Abzug

(ml)

zugegebenes

Volumen

(ml)

neues

Volumen

(ml)

0 6 10 9,98 0 9,98

0,5 5,71 9,98 9,96 0,51 10,47

1 5,43 10,47 10,45 0,53 10,98

1,5 5,17 10,98 10,96 0,56 11,51

2 4,92 11,51 11,49 0,58 12,08

2,5 4,68 12,08 12,06 0,61 12,67

3 4,46 12,67 12,65 0,64 13,29

3,5 4,24 13,29 13,27 0,67 13,94

4 4,04 13,94 13,92 0,71 14,63

4,5 3,84 14,63 14,61 0,74 15,35

5 3,66 15,35 15,33 0,78 16,11

5,5 3,48 16,11 16,09 0,82 16,91

6 3,31 16,91 16,89 0,86 17,74

6,5 3,15 17,74 17,72 0,90 18,62

7 3,00 18,62 18,60 0,94 19,55

7,5 2,86 19,55 19,53 0,99 20,52

8 2,72 20,52 20,50 1,04 21,54

8,5 2,59 21,54 21,52 1,09 22,61

9 2,46 22,61 22,59 1,15 23,74

9,5 2,34 23,74 23,72 1,20 24,92

10 2,23 24,92 24,90 1,26 26,16

10,5 2,12 26,16 26,14 1,33 27,47

11 2,02 27,47 27,45 1,39 28,84

11,5 1,92 28,84 28,82 1,46 30,29

12 1,83 30,29 30,27 1,54 31,80

12,5 1,74 31,80 31,78 1,61 33,40

13 1,66 33,40 33,38 1,69 35,07

Anhang 2

82

Tabelle 19: Konzentrationsabfall von Moxifloxacin bei einer Versuchsdauer von 12 h

Zeit (h) Konzentration

(mg/l)

Volumen

vor Abzug

(ml)

Volumen

nach

Abzug

(ml)

zugegebenes

Volumen

(ml)

neues

Volumen

(ml)

0 4 20 19,98 0 19,98

0,5 3,89 19,98 19,96 0,54 20,50

1 3,79 20,50 20,48 0,55 21,03

1,5 3,69 21,03 21,01 0,57 21,58

2 3,60 21,58 21,56 0,58 22,14

2,5 3,50 22,14 22,12 0,60 22,72

3 3,41 22,72 22,70 0,61 23,31

3,5 3,32 23,31 23,29 0,63 23,92

4 3,23 23,92 23,90 0,65 24,55

4,5 3,15 24,55 24,53 0,66 25,19

5 3,06 25,19 25,17 0,68 25,85

5,5 2,98 25,85 25,83 0,70 26,53

6 2,90 26,53 26,51 0,72 27,23

6,5 2,83 27,23 27,21 0,74 27,94

7 2,75 27,94 27,92 0,75 28,68

7,5 2,68 28,68 28,66 0,77 29,43

8 2,61 29,43 29,41 0,79 30,20

8,5 2,54 30,20 30,18 0,82 31,00

9 2,48 31,00 30,98 0,84 31,82

9,5 2,41 31,82 31,80 0,86 32,66

10 2,35 32,66 32,64 0,88 33,52

10,5 2,29 33,52 33,50 0,91 34,40

11 2,23 34,40 34,38 0,93 35,31

11,5 2,17 35,31 35,29 0,95 36,25

12 2,11 36,25 36,23 0,98 37,20

Anhang 3

83

Tabelle 20: Auswahl an PK/PD-Indizes, Art und Ergebnisse der Untersuchungen und jeweils verwendete Antibiotika bzw. Antibiotikaklassen

PK/PD-

Index

Art der Untersuchung,

Antibiotika bzw.

Antibiotikaklassen

Ergebnisse Autor und

Jahr

Cmax/MHK in vitro Modell mit

Enoxacin und Netilmicin

bakterielles Wiederwachstum nur bei

Cmax/MHK < 8:1

Blaser,

1987 [24]

AUC/MHK verschiedene Tiermodelle

mit Fluorchinolonen

Letalität bei Pneumonie, Sepsis oder

Peritonitis >50% bei AUC/MHK

<30, sehr niedrige Letalität bei

AUC/MHK >100

Craig, 1998

[38]

Cmax/MHK Tiermodell mit

Lomefloxacin

signifikant verbessertes klinisches

Outcome bei Sepsis durch P.

aeruginosa bei Cmax/MHK 20:1

Drusano,

1993 [47]

AUC/MHK kliniche Studie mit

Levofloxacin

signifikante Eradikation von P.

aeruginosa und MRSA bei

AUC/MHK >87 bei nosokomialen

Pneumonien

Drusano,

2004 [48]

AUC/MHK in vitro Modell mit

Moxifloxacin und

Levofloxacin

AUC/MHK ~ 80 für Moxifloxacin

führt zu vergleichbaren Intensität des

antibakteriellen Effekts wie

AUC/MHK ~ 130 für Levofloxacin

Firsov,

2000 [56]

AUC/MHK in vitro Modell mit

Gemifloxacin und

Ciprofloxacin

AUC/MHK ~ 110 für Gemifloxacin

führt zu vergleichbaren Intensität des

antibakteriellen Effekts wie

AUC/MHK ~ 125 für Ciprofloxacin

Firsov,

2000 [57]

AUC/MHK klinische Studie mit

Ciprofloxacin

AUC/MHK >100 korreliert gut mit

klinischem Outcome bei pulmonalen

Infektionen

Forrest,

1993 [58]

AUC/MHK in vitro Modell mit

Levofloxacin und

Moxifloxacin

beste Eradikation von MRSA bei

AUC/MHK ~ 30

Lee, Fan,

2007 [98]

Anhang 3

84

PK/PD-

Index

Art der Untersuchung,

Antibiotika bzw.

Antibiotikaklassen

Ergebnisse Autor und

Jahr

AUC/MHK in vitro Modell mit

Moxifloxacin

99% Eradikation von E. coli bei

AUC/MHK ~ 105-148

99% Eradikation von B. fragilis bei

AUC/MHK ~ 81

Noel,

2005 [122]

AUC/MHK

Cmax/MHK

in vitro Modell mit

Levofloxacin und

Moxifloxacin

AUC/MHK ~100 und Cmax/MHK ~

10:1 beider Substanzen führten zu

maximalen Eradikationen der

untersuchten S. pneumoniae, S.

aureus, K. pneumoniae und E. coli

Stämme

Oldenholt,

Cars, 2006

[124]

AUC/MHK in vitro Modell mit

Levofloxacin und

Trovafloxacin

AUC/MHK <44 bei Levofloxacin

und Trovafloxacin fördern

Resistenzentstehung bei B. fragilis;

AUC/MHK >122 bei beiden

Substanzen führte zu vollstädiger

Eradikation und Verhinderung

Wiederwachstum von B. fragilis

Peterson,

2002 [131]

AUC/MHK in vitro Modell mit

Moxifloxacin

AUC/MHK >180 für Moxifloxacin

führte zu vollständiger Eradikation

und dauerhafter

Wachstumsunterdrückung unter

Verwendung eines hohen E. coli

Inokulums (2 x 108 KBE/ml)

Singh,

2009 [152]

AUC/MHK retrospektiv klinische

Studien mit

Cephalosporinen,

Fluorchinolonen,

Carbapenemen

AUC/MHK <100 bei den genannten

Antibiotikaklassen fördern

Resistenzentwicklung bei

nosokomialen Pneumonien mit

gramnegativen Erregern

Thomas,

1998 [175]