Schimmelpilzgift Patulin - Analyse in Fruchtsaft und ... · Schimmelpilzgift Patulin - Analyse in...

Schimmelpilzgift Patulin -

Analyse in Fruchtsaft und -püree sowie Kindernahrung

mittels ACQUITY UPLC H-Class + Xevo TQ-XS

Gliederung

❙ Allgemeine Einführung

Mykotoxine - eine Übersicht

Patulin - strukturelle Grundlagen, Eigenschaften und Vorkommen,

Relevanz in Fruchtsäften und Pürees

❙ Rechtlicher Rahmen und Grenzwerte

❙ Analytik

Aufarbeitung und Messung (alte und aktuelle Methoden)

❙ Methodenergebnisse

Statistische Kenndaten, Chromatogramme, praktische Erfahrungen

❙ Messresultate

vergangene Untersuchungen im Überblick

❙ Fallbeispiel einer Höchstmengenüberschreitung

| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 2

Mykotoxine

❙ Griechisch: myko = Pilz, lateinisch: toxicum = Gift

❙ Sekundäre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen

❙ Der Grund warum diese Toxine gebildet werden

ist noch nicht vollständig geklärt

❙ Schimmelpilzbefall bedeutet nicht automatisch eine

Mykotoxin-Kontamination: die Bildung

hängt von mehreren Faktoren ab

❙ Die toxische Wirkung kann chronisch oder

akut sein


eine kurze Einführung

❙ Mehr als 400

toxikologische Pilz-

Metabolite bekannt

❙ schätzungsweise

aber mehr als 1000

existent

❙ In Lebensmitteln

sind etwa 30 von

Bedeutung

Übersicht wichtiger Mykotoxine


Quelle: Bundesinstitut für Risikobewertung

Mykotoxine Produzierende vorwiegend betroffene Toxische Wirkung / Effekte

Mikroorganismen Lebensmittel

Aflatoxine Aspergillus flavus, Nüsse, Erdnüsse, Pistazien, Getreide, leberschädigend, mutagen,

Aspergillus parasiticus Hirse, sekundär aus Milch kanzerogen, teratrogen

Citrinin Penicillium citrinum Gerste, Hafer, Mais, Reis, Walnüsse nierenschädigend, mutagen,

kanzerogen (?)

Cyclopiazonsäure Aspergillus flavus, Erdnüsse, Mais, Käse Neurotoxin

Penicillium cyclopium

Desoxynivalenol Fusarium graminearum, Weizen, Gerste, Mais, Roggen Neurotoxin, immunotoxisch,

(Vomitoxin) Fusarium culmorum kanzerogen (?)

Ergotalkaloide Claviceps purpurea Roggen, Weizen, Hafer Neurotoxin, Durchblutungsstörungen,

(Mutterkornalkaloide) kanzerogen

Fumonisine Fusarium verticolloides Mais und maishaltige Produkte Neurotoxin, leberschädigend,

lungenschädigend, kanzerogen (?)

Moniliformin Fusarium verticolloides Mais und maishaltige Produkte, herzschädigend, leberschädigend,

(moniliforme) Weizen (Getreide) nierenschädigend

Ochratoxin A Aspergillus ochraceus, Getreide, Bohnen, kanzerogen, teratogen, neurotoxisch,

Penicillium verrucosum grüne Kaffeebohnen nierenschädigend

Patulin Penicillium patulum, Äpfel, Birnen, Bohnen, Weizen kanzerogen, mutagen,

Aspergillus clavatus leberschädigend

Penicillinsäure Penicillium puberulum, Mais, Gerste, Bohnen neurotoxisch

Aspergillus ochraceus

Sterigmatocystin Aspergillus versicolor, Getreide, grüne Kaffeebohnen, teratogen hautreizend, kanzerogen (?)

Aspergillus nidulans Käse

T-2 Toxin / Fusarium sporotrichioides Mais, Gerste, Hafer, Hirse starkes Neurotoxin, hautreizend,

HT-2 Toxin Fusarium poae kanzerogen

Zearalenon Fusarium graminearum Getreide schleimhautreizend, östrogen, Unfrucht-

barkeit verursachend, kanzerogen (?)

Kontamination

Primär-

kontamination

Befall bereits beim Anbau der Pflanze

Im Endprodukt nicht sichtbar

Sekundär-

kontamination

Während der Lagerung, des Transports, oder der Weiter-verarbeitung

zu erkennen

Carry Over

Tiere verzehren kontaminierte Futtermittel – Belastung der Produkte

nicht zu erkennen


Handlungsempfehlungen

zur Verringerung der Mykotoxinbelastung

❙ Befall möglichst verhindern – nachträgliches

Detoxifizieren ist nicht praktikabel bzw. unmöglich

❙ Handeln bevor es zu spät ist prophylaktisch

❙ Optimale Lagerung / Nachbehandlung

| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 6 Quelle: Bundesinstitut für Risikobewertung


Wer hat mich gesehen?

Formel: C7H6O4 Molmassse: 154,12 g/mol CAS-Nr.: 149-29-1 -> fünf-gliedriges, ungesättigtes Lacton -> weiß, kristallin -> 1941 erstmals isoliert -> genotoxisch -> hitzebeständig, säurestabil, alkaliempfindlich

Patulin

Patulin und die Apfelsaftproblematik


-> Lieblingssaft der Deutschen – durchschnittlich trinkt jeder 12-13 Liter pro Jahr

1,5 kg Äpfel 1 Liter Saft

-> durch Pasteurisieren wird der Saft haltbar gemacht

-> Es reichen geringe Mengen verschimmelter Äpfel, um eine große Menge Saft

zu kontaminieren:

waschen, verlesen,

mahlen, pressen, ggf.

zentrifugieren und filtern

1250 – 1500 kg Äpfel davon 1 kg

verfault

1000 Liter Saft enthalten

50 µg/kg Patulin

Art. 1 Abs. 1 VO (EWG) Nr. 315/93

Definition „Kontaminanten“

Art. 2 Abs. 1 VO (EWG) Nr. 315/93 Verkehrsverbot für Lebensmittel mit gesundheitsschädlichen

Kontaminanten in bedenklicher Konzentration

Art. 2 Abs. 2 VO (EWG) Nr. 315/93

Minimierungsgebot: ALATA- / ALARA- Prinzip

Art. 2 Abs. 3 VO (EWG) Nr. 315/93

Höchstmengen für bestimmte Kontaminaten

Abschnitt 2 Anhang VO (EG) Nr. 1881 / 2006

gemeinschaftsweite gültige Höchstmengen für Mykotoxine

Art. 3 Abs. 2 VO (EG) Nr. 1881 / 2006

Vermischungsverbot, Verbot der Verwendung als Zusatz


Rechtliche Grundlagen und Grenzwerte

Bestimmung mit HPLC und UV-Detektor


Typisches Chromatogramm von Apfelsaft mit etwa 13 µg/kg Patulin

Quelle: ASU (von 2010) nach § 64 LFGB L48.03-2


Analytik Probenaufarbeitung

Enzymvorbehandlung

bei trüben Saft

und Brei bzw. Mus

zentrifugieren

Dotieren der

Kalibrierung

ISTD-

Dotierung

schütteln

Rückstand aufnehmen

und überführen

Extraktion

verdünnen

abblasen

http://www.google.de/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiRxOGegqzUAhUSLVAKHSdhDnUQjRwIBw&url=http://bacteriostaticwater.com/empty-sterile-vial&psig=AFQjCNHEJkNkENF2AYB3T4xRllNahnDvCA&ust=1496934627101221



UHPLC-Methode

❙ Eluentensystem: A: H2O B: Methanol

❙ Fluss: 0,3 ml/min

❙ Injektionsvolumen: 10 µl

❙ Säule: CORTECS UPLC Shield RP18 + Vorsäule

2,1 x 50 mm; 1,6 µm

Säulentemperatur: 30 ºC

❙ Gradient

Laufzeit: 6 min

12

ACQUITY UPLC H-Class

Step Time

(min)

Flow rate

(ml/min)

%A %B Curve

1 Initial 0,300 95 5 Initial

2 1,00 0,300 95 5 6

3 2,00 0,300 5 95 6

4 4,00 0,300 5 95 6

5 5,00 0,300 95 5 6

| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth

MS-Methode

❙ Quellenparameter:

Ionization Mode: ESI negative

Capillary Voltage: 2,8 kV

Source Temperature: 150 ºC

Desolvation Temperature: 500 ºC

Cone Gas Flow: 150 l/h

Desolvation Gas Flow: 1000 l/h

❙ MS File:

13

Xevo TQ-XS (Triple Quadrupole)

| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth

Compound

Name

Parent

(m/z)

Daughter

(m/z)

Cone

(V)

Collision

(eV)

Patulin 152,99

108,89 10 8

80,90 10 12

52,97 10 12

Patulin-13C7 160,04

114,91 10 8

86,02 10 12

57,00 10 16

Validierungsergebnisse /

statistische Kennzahlen

Validierung folgender Parameter:

o Selektivität / Spezifität

o Arbeitsbereich / Kalibrierfunktion

o Präzision

o Richtigkeit

o Wiederfindungsrate

o Nachweis- / Bestimmungsgrenze

o Messunsicherheit


Compound name: Patulin

Correlation coefficient: r = 0.999766, r^2 = 0.999531

Calibration curve: 0.3219 * x + 0.0428976

Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Conc-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

Re

sp

on

se

-0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Conc

Re

sid

ua

l

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

min0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75

%

0

100

F1:MRM of 5 channels,ES-

152.995 > 80.899

170816_Patulin_L2_01 Smooth(Mn,1x2)

Patulin Validierung 170816 Kali 14.00 KiNa Apfelsaft

1.357e+006Patulin

0.96

90037

1293.40

3.25

3.66

4.244.35 4.54

min

%

0

100


152.995 > 108.889



3.014e+006Patulin

0.95

200824

86

3.52

min0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75

%

0

100


160.038 > 114.915



6.743e+005Patulin 13C7

0.95

46737

1044

R2 = 0,9995

Residuen + 3 % / -2,5 %

Dreifachbestimmung

Messergebnisse 2014 - 2018


2014 2015 2016 2017 2018

> 50 µg/l 1 0 0 1 5

10 µg/l - 50 µg/l 5 10 7 3 2

bis 10 µg/l 6 20 22 18 22

n.n. / n.b. 19 5 6 16 8

0

5

10

15

20

25

30

35

40

An

za

hl d

er

Pro

be

n m

it

en

tsp

rech

en

de

m G

eh

alt

Patulin in Fruchtsaft und Püree - Untersuchungen 2014 - 2018

Messergebnisse Kindernahrung 2014 - 2018


2014 2015 2016 2017 2018

> LOQ 2 3 1 1 0

n.n. / n.b. 16 19 11 19 13

0

5

10

15

20

25

An

zah

l d

er

Pro

ben

mit

en

tsp

rech

en

dem

Geh

alt

Patulin Kindernahrung - Untersuchungen 2014 - 2018

Fallbeispiel

❙ Ausgangspunkt: Beschwerdeprobe Apfelsaft

sensorische und chemisch-analytische Untersuchung

❙ Ergebnis Patulinanalyse: Gehalt von 1425 µg/kg - Überschreitung des max. zulässigen

Höchstgehaltes (Absicherung in 3-fach Wiederholung)

Beurteilung als gesundheitsschädlich

❙ Weiteres Vorgehen: - Verfolgs- und Verdachtsproben werden auf Patulin untersucht

- Rückrufaktion der betroffenen Chargen

- Vor-Ort-Termin des Überwachungsamtes

- Gemeinsame Betriebskontrolle von Überwachungsamt und

Landesdirektion

❙ Ursache: erhöhte Kontamination wahrscheinlich durch schlechte

Rohware und unzureichende Kontrolle

❙ Maßnahmen: Betrieb überarbeitet Qualitätsmanagement – eigenveranlasste

Untersuchung jeder Charge Saft auf Patulin


Literaturquellen

Deutsche Landwirtschaftsgesellschaft (DLG e.V.), „DLG-Expertenwissen 2/2016: Mykotoxine im Fokus“,

Prof. Dr. H. J. Buckenhüskes, Frankfurt a. M., 2016

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), „Schimmelpilzgifte in Lebensmitteln – So können Sie sich schützen“, Berlin

Bundesinstitut für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL), Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren

(ASU), §64 Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB)

Reports on tasks for scientific cooperation, Report of experts participating in Task 3.2.8 "Assessment of dietary intake of

patulin by the population of EU member states“, Directorate-General Health and Consumer Protection, März 2002

Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen (LUA)


Bildnachweise

Folie 3

https://www.duda.news/serie/giftige-und-ungiftige-schimmelpilze/

https://www.laves.niedersachsen.de/startseite/lebensmittel/lebensmittelgruppen/nuesse/nuesse-auf-dem-pruefstand-92254.html

https://www.urgeschmack.de/ist-kaffee-gesund/

https://www.gr.ch/DE/institutionen/verwaltung/dvs/alt/aktuelles/Seiten/Mykotoxine-in-Mais--und-Reiserzeugnissen.aspx

https://deacademic.com/dic.nsf/dewiki/368958

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), „Schimmelpilzgifte in Lebensmitteln – So können Sie sich schützen“, Berlin, Seite 3

Folie 6

https://www.getreidekonservieren.de/mykotoxine/

Folie 8

https://www.coopathome.ch/de/supermarkt/fr%C3%BCchte-gem%C3%BCse/fr%C3%BCchte/%C3%84pfel-birnen/naturaplan-bio-%C3%84pfel-gala-4-6-

st%C3%BCck-ca/p/3090520

https://de.dreamstime.com/lizenzfreies-stockfoto-glas-apfelsaft-image26444715

https://www.lebensmittellexikon.de/l0002330.php

https://www.augsburger-allgemeine.de/wissenschaft/Warum-Supermarkt-Aepfel-Allergikern-Probleme-bereiten-koennen-id52899796.html

https://www.kzgeurasier.de/giftig.html

https://www.heilpraxisnet.de/naturheilpraxis/unverstaendlicher-einsatz-tierischer-bestandteile-bei-der-apfelsaft-produktion-20160930204371

Folie 11

https://www.brigitte.de/rezepte/apfelsaft-selber-machen-so-gehts-ganz-leicht-11226294.html

https://www.hettich.ch/de/produkte/hettich-zentrifugen/mittel-zentrifugen/universal-320-320r

https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-products.html?TablePage=17551559



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